Immunhistochemische Charakterisierung der organotypischen Retinakulturen von B6J.Sv129 Rpgrtm1Stie-Mäusen:

Für die zur Blindheit führende X-chromosomal vererbte Retinitis pigmentosa stellen gentherapeutische Ansätze unter Nutzung von gezielten DNA-Doppelstrangbrüchen sowie zelleigener DNA-Reparaturmechanismen eine mögliche therapeutische Option dar. Entsprechende gentherapeutische Versuche könnten am Mausmodell der Rpgr-KI-Maus während der organotypischen Retinakultur erfolgen. Hierfür ist im Vorfeld die Charakterisierung der Rpgr-KI-Retina in der Retinakultur notwendig.
Retinae 3 und 9 Monate alter Rpgr-KI-Mäuse wurden für bis zu 10 Tage kultiviert. Hiernach folgte die Fixierung, Einbettung in ein Gefriermedium sowie die Anfertigung von Gefrierschnitten. Apoptosen wurden mittels TUNEL-Assay nachgewiesen. Immunfluoreszenzfärbungen erfolgten gegen neuronale Strukturen (PKCα, CtBP2, β-DG), Makroglia (GFAP, GS), Mikroglia (Iba1) und die Interphotorezeptorenmatrix (CD44). Die untersuchten DNA-Schadenserkennungs- und Reparaturproteine waren γH2AX, pATM, 53bp1, BRCA1, Ku80, DNA-PKcs und CtIP. Die Kernreihen der ONL und INL wurden im Laufe der Retinakultur gezählt und einer Regressionsanalyse unterzogen.
Eine deutliche Korrelation mit dem Kultivierungsverlauf konnte für die ONL-Kernreihen gezeigt werden, welche bei längerer Kultivierung in beiden Altersgruppen reduziert waren. Die Retinae behielten ihre typische Morphologie während der Kultivierung bei und über die strukturellen Proteine konnten bekannte retinale Degenerationsprozesse wie sprouting und Gliose nachgewiesen werden. DNA-Schadenserkennungs- und -Reparaturproteine ließen sich ebenfalls in den Retinae darstellen.
Es kam wie in anderen Retinakulturen zur Photorezeptordegeneration, wobei dies in älteren Rpgr-KI-Retinae möglicherweise durch eine in vivo akkumulierende Vorschädigung beschleunigt wurde, welche zu einem stärkeren und früheren Verlust der Photo¬rezeptoren führte. Die typischen retinalen Degenerationsprozesse traten früher als in kultivierten Wildtyp-Retinae auf. Der Großteil der DNA-assoziierten Proteine konnte im retinalen Gewebe nachgewiesen werden, jedoch war die Anfärbung in den ONL-Kernen mit ihrer invertierten Chromatinstruktur gering. Davon ausgenommen war Ku80, das während der Kultivierung eine Translokation von der OPL in die ONL hinein zeigte. Die Ergebnisse zeigen, dass die organotypische Retinakultur der Rpgr-KI-Maus vital mit weiterhin ablaufenden Umbauprozessen ist, eine Expression der untersuchten DNA-Reparaturproteine aufweist und sich somit für gentherapeutische Versuche anbietet. Gene therapy through the use of targeted DNA double strand breaks and the cell’s own DNA repair mechanisms represents a possible therapeutic approach for X-linked retinitis pigmentosa that normally leads to blindness. Such gene therapeutic approaches could be tested during the organotypic culture of retinal explants from the Rpgr knock in mouse model. Pre-emptively, the need for characterization of the Rpgr-KI mouse during retinal culture arises.
Retinae from 3 and 9 month old Rpgr-KI mice were cultured for up to 10 days. Fixation, embedment into freezing medium and preparation of frozen sections followed. Assessment of apoptosis took place via TUNEL-assay. Further staining was made via immunofluorescence and targeted neuronal structures (PKCα, CtBP2, β Dystroglycan), gliosis (GFAP, GS), micro glia (Iba1), the interphotoreceptor matrix (CD44) and multiple proteins for DNA damage detection and repair (γH2AX, pATM, 53bp1, BRCA1, Ku80, DNA-PKcs, CtIP). Nuclear rows in the ONL and INL were counted over the course of culture. These counts were subjected to a regression analysis.
There was a clear correlation between time in culture and the ONL nuclear rows, which were reduced in both age groups the longer the time in culture was. Retinae retained their typical morphology during cultivation and via the structural proteins well known processes of retinal degeneration like sprouting and gliosis could be detected. The DNA damage detection and repair proteins inside the retina could be evidenced as well.
Like in other retinal explant cultures degeneration of photoreceptors occurred, although the loss of photoreceptors in older Rpgr-KI retinae was faster and more severe than in younger retinae. This might be due to preceding and accumulative damage in vivo. Typical retinal degenerative processes took place earlier than in wild type mice. Most of the DNA associated proteins could be found inside the retina, albeit with only limited staining inside the ONL nuclei with their inverted chromatin structure. Ku80 was exempt from this and during the time course of cultivation showed a translocation from the OPL towards the ONL. The results show that the organotypic cultures of retinal explants from Rpgr-KI mice are vital with continuing remodeling processes as well as existent expression of the investigated DNA associated proteins and thus are viable for future gene therapeutic testing.