Molekularbiologische Strategien zur Erhöhung der Produktion von bakteriellen Membranvesikeln sowie die Produktion von SARS-CoV-2 Spike S1-Protein haltigen bakteriellen Membranvesikeln

Bakterielle Membranvesikel (BMV’s) stellen einen vielversprechenden Ansatz für die Vakzinierung dar. Von Bakterien zu jeder Zeit des Wachstums sezerniert, übernehmen sie für diese eine Reihe unterschiedlichster wertvoller Aufgaben. Die BMV‘s bilden ein Langstreckentransportsystem von Bakterien, indem sie ihren Inhalt vor Degradation und Verdünnung schützen. So ermöglichen sie Bakterienzellen den Transfer einer Reihe von Biomolekülen wie etwa RNA- und DNA-Fragmenten, Autolysinen, Zytokinen, Plasmiden als auch Virulenzfaktoren und dadurch letzten Endes die Kommunikation zwischen Bakterienzellen sowie die Einflussnahme auf Wirtszellen. Ein Hindernis bei der Arbeit mit BMV‘s ist ihre Endotoxizität, verursacht durch die in ihren äußeren Membranen in großen Mengen vorkommenden Lipopolysaccharide (LPS). Vielversprechend ist jedoch die Anwendung des E. coli Stammes ClearColi®. Aufgrund der Deletion von sieben an der LPS-Synthese beteiligten Genen besitzt ClearColi® eine modifizierte LPS-Struktur, die nicht vom Toll-like-Rezeptor 4 (TLR4) erkannt wird. Dadurch weisen die aus ClearColi® gewonnenen BMV’s so gut wie keine LPS-basierte Endotoxizität auf.
In der vorliegenden Arbeit konnten erfolgreich Bakterienstämme mit gesteigerter Vesikelproduktion durch chromosomale Integration von hlyF und Deletion von nlpI generiert werden. Da diese auf Basis des Stammes ClearColi® generiert wurden, verfügen die daraus gewonnenen BMV’s nachweislich über eine sehr geringe Endotoxizität. Zudem konnten erfolgreich modifizierte BMV’s mit der Untereinheit des SARS-CoV-2 Spike S1-Proteins generiert werden. Dabei gelang durch die gezielte Induktion der S1-Protein Expression die Anreicherung des S1-Proteins in den Vesikeln.
Die Erhöhung der Produktionsmengen ist voraussetzend für die industrielle Produktion von BMV-basierten Vakzinen und die Verringerung der Endotoxizität notwendig für die Sicherheit zukünftiger Vakzine. Der Nachweis des SARS-CoV-2 S1-Oberflächenproteins in den Vesikeln zeigt wie anpassungsfähig die Methode für neue Erreger sein kann. So konnte letztendlich in dieser Arbeit das Potential der Vakzinierungsstrategie auf BMV-Basis aufgezeigt und weiter ausgebaut werden. Weitere Tierexperimente werden benötigt, um die Fähigkeit der hergestellten BMV’s bezüglich der Produktion von neutralisierenden Antikörpern gegen SARS-CoV-2 zu untersuchen. Bacterial membrane vesicles (BMV's) represent a promising approach for vaccination. Secreted by bacteria at any time of growth, they perform a number of diverse valuable tasks for them. Through their release, BMV‘s form a long-range transport system of bacteria by protecting their contents from degradation and dilution. In this way, they enable bacterial cells to transfer a range of biomolecules such as RNA and DNA fragments, autolysins, cytokines, plasmids as well as virulence factors, and ultimately enable communication between bacterial cells and influence host cells. One obstacle in working with BMV's is their endotoxicity, caused by the lipopolysaccharides (LPS) present in large amounts in their outer membranes. However, work with the strain ClearColi® with modified LPS structure is promising in this regard. Due to the deletion of seven genes that are involved in LPS synthesis in ClearColi®, these bacteria have a modified LPS structure that is not recognized by Toll-like receptor 4 (TLR4). As a result, BMV's derived from ClearColi® exhibit virtually no LPS based endotoxicity.
In the present work, bacterial strains with increased vesicle production were successfully generated by chromosomal integrating hlyF and deleting nlpI. Since these were generated based on the strain ClearColi®, the BMV's obtained from these strains have been shown to have very low endotoxicity. In addition, modified BMV's with the S1 subunit of the SARS-CoV-2 spike protein were successfully generated. Thereby, the targeted induction of S1 protein expression succeeded in enriching the S1 protein in the vesicles.
Increasing production levels is prerequisite for industrial production of BMV-based vaccines and reducing endotoxicity is necessary for the safety of future vaccines. The detection of the SARS-CoV-2 S1 surface protein in the vesicles shows how adaptable the method can be for new pathogens. Thus, ultimately, this work demonstrated and further developed the potential of the BMV-based vaccination strategy. Further animal experiments are needed to investigate the ability of the produced BMV's with respect to the production of neutralizing antibodies against SARS-CoV-2.