Endotheliale-mesenchymale Transition in hypoxen mikrovaskulären Endothelzellen und der Einfluss auf die TGFβ1/SMAD-Signalkaskade

Es wurde eine Zellkultur von Endothelzellen aus kardialen mikrovaskulären Zellen der Ratte etabliert und unter definierten hypoxen Bedingungen analysiert.
Initial wurde die Reinheit der Endothelkultur verbessert. Durch Optimierung der Kollagenase-Nachdigestion auf 45 Minuten und das zeitige Waschen der ausplattierten Zellen nach 1 Stunde Adhäsion, konnte eine 90 %ige MVECs-Reinheit erzielt werden. Diese Zellen stellten sich mikroskopisch im Monolayer endothelzelltypisch Pflasterstein-artig dar, während Zellen mit kürzerer Nachverdauung und längerer Adhäsionszeit fibroblastenartige spindelförmig-langgestreckte Zellen im Monolayer aufzeigten. Mit jeder Stufe einer Zellpassage verändert sich die Kultur, deswegen wurden hier nur erstpassagierte Zellen mit einer Konfluenz von 95 % gewählt.
An diesen Zellen untersuchte ich den Einfluss von Hypoxie und Transforming growth factor beta (TGF) auf die endotheliale-mesenchymale Transition. Die Effizienz des Sauerstoffentzuges unter Hypoxie wurde mittels der Expression von HIF-1α-Protein überprüft. HIF-1α wird hypoxie-induziert hochreguliert und zerfällt bereits nach kurzer Zeit der Reoxygenierung wieder in seine Untereinheiten. Ich konnte durch einen stark signifikanten HIF-1α Anstieg nach durchgeführter Hypoxie und Reoxygenierung die methodische Effizienz der Hypoxie in dieser Arbeit beweisen.
TGFβ ist als Wachstumsfaktor maßgeblich an Umbauprozessen am Herzen, dem kardialen Remodeling, beteiligt. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass durch Hypoxie und anschließender Reoxygenierung die bekannten intrazellulären Signalmoleküle von TGFβ1, die SMAD-Proteine, in MVECs aktiviert werden. Im Speziellen wurde die SMAD2 und SMAD1/5 Expression Hypoxie-induziert heraufreguliert. Da beide Moleküle über den TGF-Rezeptor an der Außenmembran phosphoryliert und somit aktiviert werden, lässt dies auf eine hypoxie-induzierte TGFβ1- Freisetzung schließen. Ein spezifischer TGFβ-Rezeptorinhibitor für den ALK5- Signalweg konnte die Aktivierung von SMAD2 blockieren.
Ich konnte zeigen, dass Hypoxie eine endotheliale-mesenchymale Transition (EndoMT) bewirkt, welche die Expression der mesenchymalen Marker α-SMA und FSP-1 hochreguliert. Beide Marker konnten durch den spezifischen ALK5-Inhibitor gehemmt werden, was zeigt, dass die EndoMT über den TFGβ1/SMAD2-Signalweg reguliert wird. Sehr ähnliche Ergebnisse lieferten Studien mit geringer TGFβ1-Konzentration von 0,01 ng/ml, wohingegen hohe Konzentration an TGFβ1 mit 1ng/ml eindrucksvoll eine massive Umwandlung der Endothelzellen bewirkten. Es kann geschlussfolgert werden, dass eine minimale Ausschüttung von TGFβ1 im Herzen die EndoMT triggert.
Hypoxie-induziert kam es in meiner Studie zur Reduktion in der Zellzahl, wobei diese vermutlich auf eine reduzierte Proliferationsrate zurückzuführen ist. Im Monolayer entstanden Lücken. Die rhomboiden bis ovalen Einzelzellen transformierten sich lückennah zu spindelförmigen langgezogenen Zellen, welche vornehmlich α-SMA markiert waren. Gleichermaßen wie Hypoxie provozierte TGFβ1 eine Lückenbildung.
Der Endothelzellmarker CD31 zeigte keine Veränderung seiner Expression, weder unter Hypoxie noch unter TGFβ1-Einfluss. Es lässt sich also schlussfolgern, dass die Endothelzelle weiterhin vorhanden ist nach EndoMT und mittels CD31 detektiert werden kann.
In vivo könnten bei Sauerstoffentzug, wie man ihn z.B. nach einem Herzinfarkt findet, durch EndoMT und somit die Desintegration im endothelialen Monolayer TGFβ1 und andere Wachstumsfaktoren ins Herzgewebe freigesetzt werden und mesenchymale Zellen endothelialen Ursprungs einwandern. Diese Prozesse können dann zur kardialen Fibrose beisteuern und somit die kardialen Umbauprozesse (Remodeling) nach einem Herzinfarkt verstärken. Da beide Prozesse über den TGFβ1/SMAD2-Signalweg mediiert werden, wäre es von großer Wichtigkeit, diese Signalkaskade beeinflussen zu können, um somit der Prävention von Herzmuskelschäden zu dienen. In this study, a single cell type endothelial cells culture from cardiac microvasculature of rats (MVECs) was established, and endothelilal mesenchymal transition of these cells under hypoxia or TGFβ1 was determined.
First, the purity of endothelial cell culture was improved. By optimising digestion of collagenase at 45 minutes and early washing after one hour of adhesion, I obtained a purity of 90% MVECs. These cells presented microscopically a cobblestone endothelial-like monolayer, whereas cells with shorter digestion and longer adhesion times appeared fibroblast like spindle-shaped and elongated. Due to cell transformations after every step of sub-culturing, we used just the first passage of cells at a confluence of 95 %.
To analyse the influence of hypoxia and reoxygenation on these cells, efficiency of oxygen deprivation was proven by detection of HIF-1α-protein.
Transforming growth factor beta (TGFβ) as growth factor is mainly involved in cardial transforming processes, termed cardial remodeling. In this study, it could be shown that hypoxia with following reoxygenation activates well-known signaling molecules of TGFβ1, named SMAD-proteins. In particular, hypoxia induced the expression of SMAD2 and SMAD1/5. Because both molecules are phosphorylated and activated at the outer membrane via the TGFß-receptor it might be argued that hypoxia induces TGFβ1 release from MVECs. A specific TGFβ-receptor-inhibitor against ALK5 could block the SMAD2 activation.
Furthermore, I could demonstrate that hypoxia provokes endothelial mesenchymal transition (EndoMT). This was detected by the increased expression of mesenchymal markers like α-SMA and FSP-1. The upregulation could be blocked by specific ALK5-inhibition, thereby showing contribution of TFGβ/SMAD2 signaling. Low concentrations of TGFβ1 (0,01 ng/ml) revealedvimilar results, whereas high TGFβ1 concentrations (1 ng/ml) triggerd an impressive transformation of endothel cells. It can therefore be concluded that a small release of TGFβ1 provokes a cardial EndoMT.
In our study, hypoxia induced a reduction in cell count, presumable by a diminished proliferation rate, which then contributes to pore formation in the monolayer. Once rhomboid-oval single cells transformed around the pores to spindle-shaped, mainly α-SMA marked cells. Equally to hypoxia, TGFβ1 triggered pore fomations.
The endothelial marker CD31 did not show any change in its expression, neither under hypoxia nor by TGFβ1. Thus, it can be concluded that the endothelial cell marker still exists after EndoMT.
In vivo hypoxic conditions, as they are found in myocardial infarction, may provoke EndoMT. This can contribute to desintegration of the cell layer and may facilitate immigration of endothelial derived mesenchymal cells and the release of TGFβ1 into cardiac tissue. These processes can contribute to cardiac fibrosis and heart failure progression after myocardial infarction. As both processes are mediated via TGFβ1/SMAD2 signaling, interference with this pathway should be a major aim for prevention of myocardial damage due to infarction.