Populationsstruktur, antimikrobielle Resistenz und Fitness von Pseudomonas aeruginosa bei Men-schen und Tieren

Pseudomonas aeruginosa ist einer der wichtigsten Erreger von Krankenhaus-assoziierten Infektionen beim Menschen. Bei Kleintieren ruft P. aeruginosa vor allem Otitiden, Zystitiden und Wundinfektionen hervor. Humane P. aeruginosa-Isolate weisen eine schwach klonale Populationsstruktur auf. Aus infektionsmedizinischer Sicht gelten einzelne klonale Linien weltweit als besonders erfolgreich. Neben der Zugehörigkeit zu klonalen Linien liefert das Vorliegen bestimmter Virulenzdeterminanten, darunter die Zytotoxine ExoU, ExoS und ExlA sowie einzelner Serotypen Hinweise auf die klinische Prognose einer Erkrankung durch P. aeruginosa beim Menschen.
Über die Verbreitung von P. aeruginosa bei Tieren und deren mögliche Rolle als Infektions-quelle für den Menschen ist wenig bekannt. Auch zur aktuellen Resistenzlage bei P. aeruginosa-Isolaten von Tieren in Deutschland existieren kaum Daten. Um Erkenntnisse über die Populationsstruktur, das Vorkommen antimikrobieller Resistenzen, die Fähigkeit zur Biofilmbildung sowie über das Virulenzpotential von veterinärmedizinischen P. aeruginosa-Isolaten zu erhalten, wurden in der vorgelegten Arbeit 517 Isolate vom Tier geno- und phä-notypisch untersucht. Aufgrund des engen Zusammenlebens mit dem Menschen und einem klinischen Versorgungsumfeld, das Parallelen zur Humanmedizin aufweist, wurde der Hauptfokus der Probenauswahl auf Isolate von Hunden und Katzen gelegt (n = 399). Daneben wurden 57 Isolate von Nutztieren, sieben von Pferden und 24 Isolate von Reptilien, Exoten und Vögeln in die Stichprobe inkludiert. Entsprechend der größten klinischen Relevanz wurden bevorzugt P. aeruginosa-Isolate aus dem Ohr (n = 250), aus Wunden (n = 51) und aus Urin (n = 45) berücksichtigt. Die weiteren Isolationsorte verteilten sich wie folgt: sonstige Organe (n = 56), Respirationstrakt (n = 48), Haut (n = 11), klinische Umgebung (n = 11), Kot (n = 9) und sonstiges Probenmaterial (n = 36). Des Weiteren wurden 70 klinische P. aeruginosa-Isolate aus medizinischen mikrobiologischen Laboreinrichtungen der Humanmedizin zu Vergleichszwecken inkludiert, welche bereits nach MRGN-Status und Isolationsort (v. a. Wunde, Urin Respirationstrakt) vorselektiert waren.
Mittels Bouillon-Mikrodilution wurden Daten zur Minimalen Hemmkonzentration (MHK) von 19 antimikrobiellen Substanzen bei 281 P. aeruginosa-Isolaten vom Tier erhoben und ver-gleichend nach Grenzwerten der CLSI und von EUCAST ausgewertet. Verglichen mit öffent-lich verfügbaren Daten aus der Antibiotika-Resistenz-Surveillance (ARS) des Robert Koch-Instituts aus über 50 Laboren in Deutschland zeigte sich unter den Tier-Isolaten bei nahezu allen getesteten Wirkstoffen eine entspanntere Resistenzsituation. Lediglich gegen Amino-glykoside wurden in der vorgelegten Studie höhere Resistenzraten ermittelt. So waren 8,7 % der Tier-Isolate resistent gegen Amikacin, wohingegen bei der ARS (2017) nur 2,9 % der P. aeruginosa-Isolate im stationären und ambulanten Versorgungsbereich eine Amikacinre-sistenz aufwiesen (EUCAST). Achtzehn der 281 Tier-Isolate (6,4 %) zeigten eine verminder-te Empfindlichkeit oder Resistenz gegen Imipenem (MHK > 2, CLSI), die in den meisten Fällen mit einer Mutation im Gen des OprD-Porins erklärt werden konnte. Weder mittels PCR noch Analyse der Ganzgenomsequenzen wurden Carbapenemasegene nachgewiesen. Alle acht Imipenem-resistenten (MHK ≥ 8 mg/l, CLSI) P. aeruginosa-Isolate vom Tier zeigten eine verringerte in vitro-Fitness in Kompetition mit den zwei zu Vergleichszwecken herangezogenen IMP-sensiblen Vergleichsstämmen PAO1 (Wunde, Mensch) und PA14 (Wunde, Mensch).
Insgesamt wiesen 8,5 % der veterinärmedizinischen Isolate einen 3MRGN- und 0,7 % einen 4MRGN-Status auf. Diese Isolate stammten alle von Kleintieren. Bei erneutem Vergleich mit Daten aus der Humanmedizin der ARS 2015 des RKI lag der Anteil der 3MRGN-Isolate beim Tier zwischen den Werten aus Ambulanz (3,2 %, n = 6748) und Intensivstation (13,4 %, n = 3145). 4MRGN Tier-Isolate wurden in der vorgelegten Arbeit deutlich seltener als in der Humanmedizin nachgewiesen (ambulant: 1,5 %; Intensivstation: 7,7 %).
Eine repräsentative Auswahl von 105 Isolaten (n = 76 Tier, n = 29 Mensch) wurde Gesamt-genom-sequenziert. Unter ihnen zeigte sich eine heterogene Populationsstruktur, wobei der Großteil der nachgewiesenen Multilokus-Sequenztypen bereits bei Isolaten, die mit humanen Infektionen assoziiert waren, gefunden wurde. Die 76 veterinärmedizinischen Isolate verteilten sich auf 62 bekannte und 11 bis dato unbekannte STs (ST3475 - ST3484, ST3502). Auch die 16 STs der 29 humanen Isolate dieser Studie wiesen Überschneidungen mit den veterinärmedizinischen Isolaten von Kleintieren auf. Am häufigsten wurde sowohl unter den 29 humanen als auch unter den 105 Tier-Isolaten der internationale Klon ST235 (n = 7, n = 4) gefunden. Die Tier-Isolate stammten von drei Hunden und einem Pferd. Daneben wurden bei den veterinärmedizinischen Isolaten zwei weitere Hochrisikoklone gefunden (ST395, ST244). Diese Isolate stammten von Hunden (n = 3; 2 x Wunde, BAL) und Katzen (n = 2; Urin). Ein Vergleich der konkatenierten MLST-Sequenzen der 105 Isolate brachte mehrere Subcluster hervor: Die größten zwei Gruppen bildeten Isolate, die die klassischen zytotoxischen Virulenzgene (exoU/exoS) trugen. Daneben bildeten drei Tier-Isolate ein weiteres Cluster. Diese ähnelten dem als “Ausreißerstamm“ publizierten Isolat PA7 (NC_009656.1) zwar durch das Fehlen eines Typ-III-Sekretionssystems (T3SS) und von exoU/exoS sowie dem Tragen des exlA-Gens (Zytotoxin), jedoch wiesen sie 156-160 SNPs Unterschied in ihren konkatenierten MLST-Sequenzen zu ihm auf. Daneben bildeten drei weitere Tier-Isolate, die ein T3SS, jedoch weder exoU/exoS noch exlA trugen, ein eigenständiges Subcluster.
Unter den Tier-Isolaten wurden ebenso wie unter den humanen Isolaten am häufigsten die Serotypen O6 (28,9 %) und O11 (18,4 %) nachgewiesen. Stämme dieser Serotypen werden in der Humanmedizin vermehrt als Verursacher von nosokomialen Pneumonien beschrieben. Bei dem Vergleich von Serotyp und Hauptvirulenzgen fiel auf, dass der Großteil des Serotyps O11 (83,3 % = Tier vs. 90 % = Mensch) das exoU-Gen trug, wohingegen Isolate des Serotyps O6 zu 92,6 % (Tier) bzw. 100 % (Mensch) exoS+ waren.
Unter 22 getesteten P. aeruginosa-Isolaten zeigten sowohl die sechs humanen als auch die 16 veterinärmedizinischen Isolate im Mangelmedium eine stärkere Biofilmbildung. Unter-schiede in der Stärke der Biofilmproduktion zwischen humanen und Tier-Isolaten sowie Iso-laten unterschiedlicher STs konnten nicht festgestellt werden. Jedoch produzierten die 3/4MRGN-Isolate im Kristallviolett-Mikrotiterplattenversuch-Versuch und die exoS+-Isolate (vs. exoU/exlA) im Silikonfolienversuch mehr Biofilm. Diese Kombination verdeutlicht die Notwendigkeit adäquater Therapieoptionen, da die Biofilmbildung den wichtigsten Faktor chronischer Infektionen darstellt.
Bei der Untersuchung der schwimmenden Fortbewegung zeigten die 93 getesteten P. aeruginosa-Isolate (n = 68 Tier; n = 25 Mensch) eine gesteigerte Motilität bei 37°C gegenüber 28 °C und 3/4MRGN-Isolate eine verminderte Motilität gegenüber nicht-MRGN-Isolaten. Der Zusatz einer subinhibitorischen Konzentration der Antibiotika Ciprofloxacin, Meropenem oder Amikacin führte zu einer verminderten Motilität. Dies könnte eine Verringerung der Pathogenität von P. aeruginosa bedingen und insbesondere bei Pneumonien die Kombinationstherapie aus β-Laktamantibiotikum und Amikacin/Tobramycin erweitern.
Im Galleria mellonella-Infektionsmodell zeigten die acht Kleintierisolate ohne exoU/exoS eine signifikant geringere in vivo-Virulenz gegenüber Isolaten mit einem der Virulenzgene. Zwi-schen MRGN- und nicht-MRGN-Isolaten konnte in diesem Modell kein Unterschied nachge-wiesen werden.
Abschließend lässt sich festhalten, dass die P. aeruginosa-Population bei Isolaten vom Tier, und hier insbesondere Isolate vom Kleintier, große Überschneidungen mit humanen Isolaten aufweist. Bis auf eine Ausnahme stammten alle Hochrisiko-Klone und alle 3/4MRGN-Isolate von Kleintieren. Dies unterstreicht die Notwendigkeit der Aufnahme von Kleintieren in ent-sprechende Monitoringprogramme. Insbesondere das Ausmaß und die Richtung der mögli-chen Übertragung zwischen Mensch und Tier bedarf vor dem Hintergrund des „One-Health“-Gedankens weiterer Untersuchungen. Die Hinweise auf einen Zusammenhang zwischen bestimmten Virulenzgenen bzw. der Multiresistenz und Fähigkeit zur Biofilmproduktion könnten in weiterführenden Explantat-Versuchen in annähernder in vivo-Situation überprüft werden. Auch die verminderte Motilität bzw. Virulenz unter Zusatz einer subinhibitorischen Antibiotikamenge bietet einen Ansatz für weitere in vivo Untersuchungen. Pseudomonas aeruginosa is one of the most important pathogens of hospital-acquired infections in humans. In small animals, P. aeruginosa primarily causes otitis, cystitis, and wound infections. Pseudomonas aeruginosa isolates exhibit a weakly clonal population structure. From an infectious disease perspective, certain clonal lineages are particularly successful worldwide. In addition to the clonal lineage, the presence of specific virulence determinants, e.g. the cytotoxins: ExoU, ExoS, and ExlA, and some serotypes, give a hint on the clinical prognosis of P. aeruginosa disease in humans. Little is known about the spread of P. aeruginosa in animals and its potential role as a source of infection in humans. Besides, there is insufficient data on the current resistance situation of P. aeruginosa isolates from animals in Germany.
It is this study’s purpose to gain an understanding of the population structure, the occurrence of antimicrobial resistance, the ability to form biofilms, and the virulence potential of veterinary P. aeruginosa isolates. Therefore, 517 isolates from animals were genotypically and phenotypically examined.
Due to the close coexistence with humans and a clinical care setting that parallels human medicine, the sample selection's main focus was on isolates from dogs and cats (n = 399). Besides, 57 isolates from farm animals, seven isolates from horses, and 24 isolates from reptiles, exotics, and birds were included in the sample. In accordance with the greatest clinical impact, P. aeruginosa isolates from the ear (n = 250), wounds (n = 51), and urine (n = 45) were preferentially included. The remaining isolation sites were distributed as follows: other organs (n = 56), respiratory tract (n = 48), skin (n = 11), clinical environment (n = 11), feces (n = 9), and other sample material (n = 36). Further, 70 clinical P. aeruginosa isolates from medical microbiological laboratories in human medicine were included for comparison, following a preselection based on MRGN status and isolation site (especially wound, urine respiratory tract).
Data on the minimum inhibitory concentration (MIC) of 19 antimicrobial substances were collected from 281 P. aeruginosa isolates from animals and comparatively evaluated based on CLSI and EUCAST breakpoints. Compared with publicly available data from the Antibiotic Resistance Surveillance (ARS) of the Robert Koch Institute based on 60 German laboratories, the animal isolates' resistance situation was observed to be more relaxed for the vast majority of all tested substances. Higher resistance rates were only observed for aminoglycosides. Specifically, 8.7% of animal isolates showed resistance to amikacin, while only 2.9% of P. aeruginosa isolates in the inpatient and outpatient care setting showed amikacin resistance in ARS (2017) (EUCAST). Eighteen of the 281 animal isolates (6.4%) showed decreased sensitivity or resistance to imipenem (MIC > 2, CLSI), which in most cases could be explained by a mutation in the gene coding for the OprD porin. Neither PCR nor whole-genome sequence analysis detected any carbapenemase genes. All eight imipenem-resistant (MIC ≥ 8 mg/l, CLSI) P. aeruginosa isolates from animals showed reduced in vitro fitness in competition with the two IMP-sensitive comparator strains PAO1 (wound, human) and PA14 (wound, human). Overall, 8.5% of the veterinary isolates displayed a 3MRGN status and 0.7% a 4MRGN status. All these isolates originated from small animals. When again compared to data from human medicine (2015 RKI ARS), the proportion of 3MRGN isolates in animals ranged between those from outpatient (3.2%, n = 6748) and ICU (13.4%, n = 3145). 4MRGN animal isolates were detected much less frequently in the presented work than in human medicine (outpatient: 1.5%; ICU: 7.7%).
A representative sample of 105 isolates (n = 76 animal, n = 29 human) was examined by whole-genome sequencing. A heterogeneous population structure was revealed among them, with the majority of the detected multilocus sequence types already found in isolates associated with human infections. The 76 veterinary isolates were distributed among 62 known and 11 previously unknown STs (ST3475 - ST3484, ST3502). The 16 STs among the 29 human isolates in this study also showed overlaps with small animals' veterinary isolates.
The international clone ST235 was found most frequently among both the 29 human and 105 animal isolates (n = 7, n = 4). The animal isolates derived from three dogs and one horse. Also, two other high-risk clones were detected among the veterinary isolates (ST395, ST244). These isolates derived from dogs (n = 3; 2 x wound, BAL) and cats (n = 2; urine) respectively. A comparison of concatenated MLST sequences of the 105 isolates revealed several subclusters: The largest two groups were formed by isolates carrying the classical cytotoxic virulence genes (exoU/exoS). Besides, three animal isolates formed another cluster. These resembled the "outlier strain" PA7 (NC_009656.1) by lacking a type III secretion system (T3SS) and exoU/exoS and carrying the exlA gene (cytotoxin). Nevertheless, they possessed 156-160 SNPs difference in their concatenated MLST sequences to PA7. Besides, three other animal isolates carried a T3SS, but neither exoU/exoS nor exlA, thereby forming an independent subcluster.
Among both animal and human isolates, serotypes O6 (28.9%) and O11 (18.4%) were detected most frequently. Strains of these serotypes are increasingly described as causative agents of nosocomial pneumonia in human medicine. When serotype and major virulence gene were compared, it was noticeable that the majority of serotype O11 (83.3% = animal vs. 90% = human) carried the exoU gene, whereas isolates of serotype O6 were 92.6% (animal) and 100% (human) exoS-positive.
Among 22 P. aeruginosa isolates tested, both human (n = 6) and veterinary (n = 16) isolates showed increased biofilm formation in the deficiency medium. No difference in the strength of biofilm production was found between human and veterinary isolates and isolates of different STs in this study. However, the 3/4MRGN- (KV-MTP) and the exoS+ isolates (silicone disc assay) produced increased biofilm. This combination highlights the need for adequate therapeutic options, as biofilm formation is the most critical factor of chronic infections.
When swimming locomotion was examined, the 93 P. aeruginosa isolates (n = 68 animal; n = 25 human) showed increased motility at 37°C compared to 28°C, and 3/4MRGN isolates showed decreased motility compared to non-MRGN isolates. The addition of a subinhibitory concentration of the antibiotics ciprofloxacin, meropenem, or amikacin resulted in decreased motility. This could reduce the pathogenicity of P. aeruginosa and extend the combination therapy of β-lactam antibiotic and amikacin/tobramycin, especially in pneumonia.
In the Galleria mellonella infection model, the eight small animal isolates without exoU/exoS showed significantly lower in vivo virulence compared to isolates with one of these virulence genes. However, no difference regarding in vivo virulence was detected between MRGN and non-MRGN isolates.
In conclusion, the P. aeruginosa isolates from animals, and particularly isolates from small animals, show considerable overlap with human isolates. All except for one of the high-risk clones and all 3/4MRGN isolates were isolated from small animals. These results highlight the need for inclusion of small animals in future monitoring programs. In particular, the extent and direction of possible transmission between humans and animals require further investigation acknowledging the "One Health" concept.
The reference to a correlation between certain virulence genes or multidrug resistance and biofilm production capability could be investigated in further explant experiments in an approximate in vivo situation. Also, the reduction of motility or virulence under addition of a subinhibitory antibiotic concentration offers an approach for further in vivo investigations.