Listeriolysin O-manipulierte intrazelluläre Wachstumsverhalten von Listeria monocytogenes in Makrophagen und der Einfluss auf die Phagozytose

In dieser Arbeit wurde der Einfluss von durch LLO WT- und LLO-Varianten-induzierten Plasmamembranschäden auf das intrazelluläre Überleben von L. monocytogenes im Kontext von auto- und phagozytären Prozessen in murinen P388D1 Monozyten-Makrophagen untersucht. Sowohl die Autophagie als auch die LAP induzieren eine LC3-Konversion und können in die Zelle eingedrungene Pathogene eliminieren. Die Autophagie ist charakterisiert durch bimembranöse Vakuolen, die LAP dagegen durch unimem-branöse Vakuolen. Die LAP ist typischerweise NOX2- und PI3K-abhängig. Die LLO-Varianten können lediglich an die Plasmamembran binden und in ihr inserieren, aber keine Ca2+-permeable Pore bilden, sodass sie den Teil der von LLO WT-induzierten unvollständigen Porenbildung repräsentieren. In HeLa-Zellen konnte bei der Infektion mit L. monocytogenes WT ein NBR1- und GBP1- abhängiger wachstumsrestringierender Mechanismus beobachtet werden. NBR1 reguliert zusätzlich das Wachstum von L. monocytogenes ∆hly. Dagegen reguliert GBP1 nicht das Wachstum von L. monocytogenes ∆hly und L. monocytogenes ∆actA. In Makrophagen konnten drei unterschiedliche durch LLO WT- und LLO-Varianten-induzierte Mechanismen unterschieden werden: LLO WT induziert einen p62/SQSTM1 abbauenden, von der Ca2+-permeablen vollständigen Porenbildung sowie von dem aktivierten NOX2-Komplex-abhängigen und von dem PI3K-unabhängigen Mechanismus, der mit geringem intrazellulären Wachstum von L. monocyotgenes WT einhergeht und wenig unimembranöse Vakuolen ausbildet (Autophagie und wahrscheinlich auch zu einem geringen Anteil modifizierte LAP). LLO-Varianten dagegen induzieren einen nicht-degradierenden Mechanismus. L. monocytogenes LLOS176W induzieren einen nicht-wachstumsfördernden und nur mit wenigen unimembranösen Vakuolen einhergehenden Mechanismus (a.e. modifizierte Autophagie). Der durch L. monocytogenes LLOK175E- und durch L. monocytogenes LLOE262W-induzierte Mechanismus ist stark wachstumsfördernd und zeigt viele unimembranöse Vakuolen (L. monocytogenes LLOK175E). Dieser Mechanismus führt zu einer starken Ca2+-unabhängigen, PI3K-unabhängigen LC3-Konversion ohne Aktivierung des NOX2-Komplexes und zu keinem Abbau von p62/SQSTM1 (a.e. modifizierte LAP). Diese Arbeit zeigt zum ersten Mal durch Verwenden von LLO-Varianten, dass während der vollständigen Porenbildung von LLO WT das Binden an und das Inserieren in die Plasmamembran von Makrophagen bereits einen starken Einfluss auf die Phagozytose und das intrazelluläre bakterielle Wachstumsverhalten hat. Der durch LLOE262W-induzierte phagozytosefördernde Effekt ist stärker als der durch LLO WT-induzierte degradierende Mechanismus. Wahrscheinlich hängt die durch L. monocytogenes LLOS176W-induzierte nicht-wachstumsfördernde Autophagie mit der niedrigen hämolytischen Aktivität zusammen. L. monocytogenes LLOK175E und L. monocytogenes LLOE262W besitzen eine stärkere hämolytische Aktivität, überschrei-ten vermutlich einen gewissen Schwellenwert und induzieren dadurch eine wachs-tumsfördernde modifizierte LAP. This work examines the influence of LLO WT- and LLO-variants-induced plasma membrane damage on intracellular survival of L. monocytogenes in the context of autophagic and phagocytic processes in macrophages. Both autophagy and LAP induce an LC3-conversion and can eliminate cell invasive pathogens. The hallmark of autophagy applies a double-layer vacuole, whereas characteristic of LAP is a single-layer vacuole. The LAP is typically NOX2- and PI3K-dependent. The LLO-variants can only bind to and insert in the plasma membrane but can not form a Ca2+-permeable pore. They represent the part of incomplete pore formation of LLO WT.
In HeLa-cells an NBR1- and GBP1-dependent growth-restricting mechanism has been observed during L. monocytogenes WT infection. NBR1 also regulates the growth of L. monocytogenes ∆hly. GBP1 does not regulate the growth of L. monocytogenes ∆hly and L. monocytogenes ∆actA.
Three different mechanisms induced by LLO WT and LLO-variants were distinguished in macrophages: LLO WT induces a p62/SQSTM1-degrading mechanism which is dependent upon Ca2+-permeable complete pore formation as well as activated NOX2-complex, but independent of PI3K. It shows a low intracellular growth of L. monocytogenes WT and build up only few single-layer vacuoles (autophagy and probably also to a small extent modified LAP).
In contrast, LLO-variants induce a non-degrading mechanism. L. monocytogenes LLOS176W induce a mechanism which is not growth-promoting and associated with only few single-layer vacuoles (most likely modified autophagy).
The L. monocytogenes LLOK175E- and L. monocytogenes LLOE262W-induced mechanism is strongly growth-promoting and shows many single-layer vacuoles (L. monocytogenes LLOK175E). This mechanism induces a LC3-conversion which is independent of Ca2+ and PI3K, without activating the NOX2-complex and does not degrade p62/SQSTM1 (most likely modified LAP).
This work demonstrates for the first time by using LLO-variants that during complete pore formation of LLO WT, binding to and insertion into the plasma membrane of macrophages already has a strong influence on phagocytosis and intracellular growth be- haviour. The phagocytosis-promoting effect induced by LLOE262W is stronger than the degrading mechanism induced by LLO WT. Probably the non-growth-promoting auto-phagy induced by L. monocytogenes LLOS176W is related to the low haemolytic activity. L. monocytogenes LLOK175E and L. monocytogenes LLOE262W have a stronger haemolytic activity, presumably exceed a certain threshold and thereby induce a growth-promoting modified LAP.