Veränderungen der intrazellulären schmerzsensibilisierenden Signaltransduktion sensorischer Neurone im Rattenmodell der diabetischen Neuropathie

Changes in intracellular pain sensitizing signaling pathways in sensory neurons in a rat model of diabetic neuropathy

To identify changes in intracellular pain sensitizing pathways in a rat model of diabetic neuropathy this study performed qualitative and quantitative analysis. Streptozotocin (STZ) injection was used as an established substance-­induced model of diabetic neuropathy. STZ-­induced changes were analyzed in vivo using blood glucose measurements and mechanical pain threshold measuring via paw pressure test, reflecting the reproducibility of the model. Quantitative studies were performed on dorsal root ganglions in vitro. The fairly new technology of High Content Screening Microscopy was used to analyze pain sensitizing signaling pathways. In vivo studies showed that all animals that developed hyperglycemia also developed a neuropathy, as demonstrated by a decreased pain threshold. Furthermore, it was also demonstrated, that up to 50 % of the animals that received STZ did not become hyperglycemic within 2 weeks. They were either excluded from the study, or investigated as a separate group, but this did not result in significant findings. Cellular analysis showed that there is neither ubiquitous lack of neurons in the STZ model, nor loss of a specific subgroup. The distribution of neuron subtypes, as determined using the subtype markers TRPV1, Nav1.8, CGRP, CamKIIα, IB4, RIIβ and NF-­200, was identical in both phenotypes. To identify changes in the sensitizing signaling pathways themselves, stimulating agents were used and the downstream mediators Proteinkinase II (PKA-­II) and Extracellular-­signal regulated kinase 1/2 (ERK1/2) were measured as markers of activation. Prostaglandin 2 (PGI2) induced activation of PKA-­II was identical in both phenotypes, increasing rapidly after stimulation and then decreasing slowly to baseline within 2 hours. Oncostatin M showed an identical activation of ERK1/2 in both phenotypes as well. Stimulation with nerve growth factor (NGF) resulted in a high variability in ERK1/2 activation. Response to NGF was markedly increased in the STZ group compared to control animals, prompting further analysis of the NGF-­ERK1/2 pathway. NGF binds to Tropomyosin receptor kinase A (TrkA) inducing the activation of the signaling cascade. This results in phosphorylation of proteins and kinases like Ras, Raf and MEK, leading to activation of ERK1/2. Expression of TrkA was elevated in small neurons and correlated with the NGF responsive neurons showing a high amount of phosphorylated ERK1/2 upon stimulation. This distribution of TrkA could also be observed in the STZ model. No change could be observed in basal ERK1/2 expression between STZ-­treated and control animals. Dose-­response analysis showed a strong NGF dose-­dependent phosphorylation of ERK1/2, but no difference between the groups. Unexpectedly the total number of neurons isolated from STZ-­treated animals was always higher, compared to those from control animals. Veränderungen der intrazellulären schmerzsensibilisierenden Signaltransduktion sensorischer Neurone im Rattenmodell der diabetischen Neuropathie

Zur Identifizierung von Veränderungen in der intrazellulären schmerzsensibilisierenden Signaltransduktion im Tiermodell der diabetischen Neuropathie wurden im Rahmen dieser Arbeit qualitative und quantitative Untersuchungen durchgeführt. Als Modell wurde das bereits etablierte, substanzinduzierte, diabetische und neuropathische Streptozotocin-­Modell der Ratte verwendet. Die durch Streptozotocin (STZ) entstandenen Veränderungen wurden zunächst in vivo anhand von Blutglukosemessungen und Schmerzverhaltensexperimenten analysiert, auch mit Hinblick auf die Stabilität des Modells. Anschließend wurden quantitative Analysen auf zellulärer Ebene durchgeführt. Neurone der Spinalganglien aus STZ-­Tieren wurden auf schmerzrelevante Eigenschaften untersucht und mit den aus Kontrolltieren gewonnenen Neuronen verglichen. Hierfür wurde die neuartige, in der Schmerzforschung noch nicht verbreitete High Content Screening Mikroskopie verwendet. Die in vivo Experimente zeigten, dass alle Tiere, die durch STZ eine Hyperglykämie entwickelten, auch eine Neuropathie entwickelten. Diese zeigte sich durch einen herabgesetzten Schwellenwert der Schmerzinduktion. Es zeigte sich aber auch, dass nicht alle Tiere, die STZ erhalten hatten, überhaupt Diabetes entwickelten. Ca. 50 % der Tiere, die STZ erhalten hatten, zeigten nach zwei Wochen keine Hyperglykämie und wurden von der Studie ausgeschlossen. Vereinzelt wurden diese Tiere zusätzlich als separate Gruppe untersucht, zeigten aber keine Abweichungen zu Kontrolltieren. Die zelluläre Analyse zeigte zunächst, dass es im STZ-­Modell weder zu einem ubiquitären Zellverlust, noch zu einem Verlust einer spezifischen Subgruppe in den Spinalganglien kommt. Die Subgruppenverteilung, gemessen an den Markerproteinen TRPV1, Nav1.8, CGRP, CamKIIα, IB4, RIIβ und NF-­200 stellte sich in beiden Phänotypen identisch dar. Zur Feststellung etwaiger Veränderungen in der intrazellulären Signaltransduktion wurden bekannte schmerzsensibilisierende Mediatoren verwendet und ihre Zielproteine PKA-­II und ERK1/2 untersucht. Die PGI2 induzierte Aktivierung von PKA-­II wurde anhand der phosphorylierten Untereinheit pRII gemessen und zeigte in beiden Phänotypen einen identischen, zeitabhängigen Verlauf, der zuerst einem starken Anstieg unterlag und dann innerhalb von 2 h wieder auf die Ausgangsintensität sank. OSM zeigte im STZ-­Modell keine Abweichung in der ERK1/2-­Phosphorylierung im Vergleich zum gesunden Phänotyp. Nach Stimulation mit NGF hingegen kam es zu sehr variablen Ergebnissen. NGF induzierte im STZ-­Modell teilweise wesentlich stärkere ERK1/2-­Phosphorylierung, weshalb dieser Signalweg anschließend noch differenzierter untersucht wurde. NGF bindet an den Rezeptor TrkA und aktiviert so eine Signalkaskade über Proteine und Kinasen wie z. B. Ras, Raf und MEK, die wiederum ERK1/2 aktivieren. Die Rezeptorexpression von TrkA zeigte eine deutlich höhere Ausprägung in kleinen Neuronen und zudem eine Korrelation der Neurone, die auf eine Stimulation mit NGF mit starker ERK1/2-­Phosphorylierung reagierten. Diese Verteilung war auch im STZ-­Modell erkennbar. Die basale ERK1/2 Expression zeigte keine Abweichung. Es wurden außerdem Dosis-­Wirkungs-­Kurven erstellt, in denen erkennbar wurde, dass sich die NGF-­induzierte ERK1/2-­Phosphorylierung dosisabhängig darstellt, es aber nicht zu Abweichungen im STZ-­Modell kommt. Eine weitere, etwas unerwartete Beobachtung betraf die Anzahl der isolierten Neurone. Insgesamt wurden mehr Zellen aus dem STZ-­Modell isoliert.