Tumorintrinsische Promotoren der hepatischen Metastasierung

Die Therapiemöglichkeiten bei metastasierten maligne Melanom sind sowohl in der Tier- als auch in der Humanmedizin limitiert und besonders Patienten im Stadium IV der Erkrankung zeigen eine schlechte Prognose bezüglich des Fortschreitens der Erkrankung.
In dieser Arbeit wurde durch mehrmaliges hepatisches Passagieren der murinen Melanomzelllinie WT31, die eine Mutation im humanen NRAS besitzt, mittels intravenöser Injektion die Melanomzelllinie WT31_P5IV generiert, die zu etwa zwei Drittel (P= 0.0077) weniger in die Lunge metastasiert und etwa doppelt so viele (P=0.0531) Lebermetastasen generiert. Auch das Verhältnis Lungen- zu Lebermetastasen zeigt eine Verringerung (P=0.0005) in WT31_P5IV, was bedeutet, dass pro Lebermetastase weniger Lungenmetastasen entstehen als in WT31. Um diesen Phänotyp weiter zu charakterisieren wurden H&E- Färbungen angefertigt. Hier konnte weder in den Lungen- noch in den Lebermetastasen ein morphologischer Unterschied hinsichtlich Größe, Nekrose und Wachstumsmuster festgestellt werden. Weitergehende Untersuchungen wurden immunhistochemisch durchgeführt. Ki67, ein Marker für Proliferation, zeigt in den Lungenmetastasen von WT31_P5IV ein um die Hälfte reduziertes Signal (P=0.0171) im Vergleich zu Lungenmetastasen von WT31. Dies weist auf eine verringerte Teilungsaktivität der passagierten Melanomzellen in der Lunge hin. Um den Einfluss der hepatischen Passagierung von WT31 auf die tumoreigenen Faktoren von WT31_P5IV zu analysieren wurden immunhistochemische Untersuchungen auch in den Lebermetastasen durchgeführt. Färbungen von Ki67 (Proliferationsmarker) und cleaved Caspase-3 (Marker für apoptotische Zellen) zeigten keinen Unterschied zwischen den Lebermetastasen von WT31 und WT31_P5IV. Weiterhin zeigte auch die Analyse des vaskulären Musters in den Lebermetastasen von WT31 und WT31_P5IV keinen signifikanten Unterschied. In den Metastasen beider Zelllinien sind hauptsächlich Marker von kontinuierlichem Endothel exprimiert (Endomucin, CD31). Lebermetastasen von WT31 und WT31_P5IV zeigen also einen gleichen morphologischen Aufbau und keinen Unterschied in der Vaskularisierung (P=0.3776), Proliferation (P=0.6282) und Nekrose (P=0.1163).
Anschließend wurden beide Zelllinien molekulargenetisch charakterisiert, um tumorintrinsische Mechanismen zu evaluieren, die im Zusammenhang mit dem veränderten Metastasierungsverhalten von WT31_P5IV stehen.
Die Untersuchung der Genexpression von WT31 und WT31_P5IV zeigte in einer vergleichenden Analyse in den HALLMARK-Gensätzen eine Veränderung von Genen, die einerseits am Stoffwechsel der Zellen beteiligt sind, wie oxidative Phosphorylierung und Glykolyse und andererseits an Signalwegen von MYC-Targets, mitotische Spindel, DNA-Reparatur und PI3K/AKT/mTor.
Mit dem Seahorse Analyzer konnte die mitochondriale ATP-Produktion sowie das ATP, welches mittels Glykolyse produziert wird, in beiden Zelllinien gemessen werden. Hierbei war kein quantitativer Unterschied detektierbar (Mito-ATP-Produktionsrate: P=0.4145 und Glyko-ATP-Produktionsrate: P=0.1908).
Igfpb3 als stark herunterreguliertes Gen in WT31_P5IV (P<0.000.1) interagiert negativ mit dem AKT-Signalweg, weshalb dieser genauer analysiert wurde. Western Blot-Analysen von phosphoryliertem AKT (pAKT) und Total-AKT (AKT) zeigten eine Erhöhung des Verhältnisses von pAKT zu AKT um etwa ein Drittel (P=0.0291), was eine Aktivierung des Signalwegs bestätigt.
Durch die vaskuläre Route, die die Zellen während der Passagierung nahmen, veränderten sich die tumoreigenen Faktoren maßgeblich. Das Genexpressionsprofil der passagierten Zelllinie WT31_P5IV zeigt, dass Gene, die an der Retention und Adhäsion der Tumorzellen an das Lungengefäßbett beteiligt sind, verändert wurden. In vivo konnte dies durch einen Retentionsversuch von WT31 und WT31_P5IV bestätigt werden. Die initiale Anheftung von WT31_P5IV an das Lungenendothel war im Vergleich zu WT31 signifikant (P=0.0016) reduziert. Durch die geringere Fähigkeit am Lungenendothel zu adhärieren können die Melanomzellen WT31_P5IV leichter über den Blutstrom in die Leber gelangen.
Die wiederholte Kolonisierung von Tumorzellen in spezifischen Organen und sich daraus entwickelnde Subklone finden sich auch bei Patienten, insbesondere aufgrund der durch die verbesserten Therapiemöglichkeiten verlängerten Überlebenszeiten, sodass derartige Prozesse der wiederholten Kolonisierung und Selektion auch in Zukunft sowohl in experimentellen Modellen aber auch bei der Patientenversorgung mitberücksichtigt werden sollten. Therapeutic options for metastatic malignant melanoma are severely limited in both veterinary and human medicine, particularly for patients in stage IV with a poor prognosis.
This study aimed to address these limitations by conducting multiple hepatic passages of the murine melanoma cell line WT31, which harbors a mutation in human NRAS. Through intravenous injection, a melanoma cell line called WT31P5IV was generated, which metastasizes about two thirds (P=0.0077) less to the lungs and generates about twice as many (P=0.0531) liver metastases. The ratio of lung to liver metastases also shows a reduction (P=0.0005) in WT31_P5IV, which means that there are fewer lung metastases per liver metastasis than in WT31. H&E staining was performed to further characterize this phenotype. No morphological difference in size, necrosis and growth pattern could be detected in either the lung or liver metastases. Further investigations were carried out using immunohistochemistry. Ki67, a marker for proliferation, showed a signal reduced by half (P=0.0171) in the lung metastases of WT31_P5IV compared to lung metastases of WT31. This indicates a reduced division activity of the passaged melanoma cells in the lung. In order to analyze the influence of hepatic passaging of WT31 on the tumorigenic factors of WT31_P5IV, immunohistochemical studies were also performed in the liver metastases. Staining of Ki67 (proliferation marker) and cleaved caspase-3 (marker for apoptotic cells) showed no difference between the liver metastases of WT31 and WT31_P5IV. Furthermore, the analysis of the vascular pattern in the liver metastases of WT31 and WT31_P5IV also showed no significant difference. In the metastases of both cell lines, mainly markers of continuous endothelium are expressed (Endomucin, CD31). Thus, liver metastases of WT31 and WT31_P5IV show the same morphological structure and no difference in vascularization (P=0.3776), proliferation (P=0.6282) and necrosis (P=0.1163). To understand the altered metastatic behavior of WT31P5IV, comprehensive molecular genetic characterization was performed on both cell lines.
Remarkably, the vascular route taken by the cells during the passaging process caused significant modifications in tumor-intrinsic properties. A comparative analysis of the gene expression of WT31 and WT31_P5IV in the HALLMARK gene sets showed changes in genes involved in cell metabolism, such as oxidative phosphorylation and glycolysis, and in signaling pathways of MYC targets, mitotic spindle, DNA repair and PI3K/AKT/mTor.
The Seahorse Analyzer was used to measure mitochondrial ATP production and ATP produced by glycolysis in both cell lines. No quantitative difference was detectable (mito-ATP production rate: P=0.4145 and glyco-ATP production rate: P=0.1908).
Igfpb3, as a strongly downregulated gene in WT31_P5IV (P<0.000.1), interacts negatively with AKT signaling pathway and was analyzed in more detail. Western blot analyses of phosphorylated AKT (pAKT) and total AKT (AKT) showed an increase in the ratio of pAKT to AKT by about one third (P=0.0291), confirming activation of the signaling pathway.
The gene expression profile of the passaged cell line WT31P5IV underwent changes, primarily affecting genes associated with the retention and adhesion of tumor cells to the pulmonary vascular bed. This alteration was validated in vivo by a retention experiment comparing WT31 and WT31P5IV. Notably, the initial attachment of WT31P5IV to the lung endothelium was significantly reduced (P=0.0016) compared to WT31 and because of that, melanoma cells were more prone to reach the liver via the bloodstream. This phenomenon of repeated colonization of tumor cells in specific organs may also happen in patients who have undergone multiple treatments and should be taken into account in future considerations.