Bewertung verschiedener diagnostischer Ansätze zur Überwachung der Paratuberkulose-Freiheit von Rinderherden

Im Rahmen von Paratuberkulose-Bekämpfungsprogrammen ist es wesentlich, dass MAP-infizierte Herden mit geringem finanziellem Aufwand, aber mit ausreichender Sicherheit als solche erkannt werden. In der vorliegenden Arbeit wurden verschiedene kostengünstige Ansätze zur Herdendiagnostik der Paratuberkulose bei Rindern evaluiert. Dabei wurde auch die Eignung der Diagnostikansätze für die Detektion von Herden mit niedriger Prävalenz an MAP-Ausscheidern untersucht.
In Studie 1 wurde die Herdendiagnostik mittels gepoolter Einzeltierkotproben einer Stichprobe untersucht. Es wurde eine Untersuchung dreier Herden mit jeweils 300 Tieren nachgestellt. Jede Herde wurde durch 300 Einzeltierkotproben, die bereits auf MAP untersucht worden waren, repräsentiert. Um eine unterschiedliche Intra-Herden-Prävalenz (1,00 %; 2,00 % und 4,33 %) abzubilden, wurden n MAP-positive Kotproben mit n=3; 6; 13 und 300−n MAP-negative Kotproben zusammengestellt. Pro Herde wurden zehn Stichprobenuntersuchungen simuliert. Hierfür wurden aus den 300 Einzeltierkotproben zufällig jeweils 80 Proben ausgewählt und jeweils zu 5er und 10er Pools zusammengefasst. Pools mit mindestens einer MAP-positiven Probe wurden mittels bakterieller Kultur und Direkt-PCR untersucht. Es konnte gezeigt werden, dass ein positiver Zusammenhang zwischen der Bakteriendichte in einem Pool und der Pool-Sensitivität (Wahrscheinlichkeit, einen Pool mit mindestens einer MAP-positiven Kotprobe als MAP-positiven Pool zu erkennen) besteht. Es konnte kein signifikanter Unterschied in der Pool-Sensitivität zwischen der Untersuchung von 5er und 10er Pools festgestellt werden. Die Pool-Sensitivität der Untersuchung von 5er und 10er Pools mit Direkt-PCR lag bei 47,0 % beziehungsweise 45,9 %. Die Pool-Sensitivität einer Untersuchung mittels bakterieller Kultur wich, sowohl bei Verwendung von 5er als auch von 10er Pools, nicht signifikant von der Pool-Sensitivität einer Untersuchung mittels Direkt-PCR ab. Es konnte gezeigt werden, dass die Kombination von Direkt-PCR und bakterieller Kultur die Sensitivität signifikant erhöhen kann. Wurden bei der Untersuchung von 10er Pools beide Labormethoden kombiniert, lag die Herden-Sensitivität für die Untersuchung der gepoolten Einzeltierkotproben einer Stichprobe zwischen 67,3 % und 84,8 %. In Herden mit niedriger Prävalenz von MAP-Ausscheidern genügt eine einmalige Untersuchung gepoolter Einzeltierkotproben einer Stichprobe nicht, um die Herde mit ausreichender Sicherheit zu erkennen.
In Studie 2 wurde die Eignung wiederholter Umgebungskotproben und gepoolter Einzeltiermilchproben für die MAP-Diagnostik auf Herdenebene evaluiert, da auch bei Anwendung dieser kostengünstigen Diagnostikansätze eine einmalige Untersuchung nicht ausreicht, um niedrig-prävalente Herden mit hoher Sicherheit zu erkennen. In 36 Thüringer Milchviehherden wurden innerhalb eines Jahres jeweils zwölf Bestandsbesuche durchgeführt, bei denen jeweils neben einer Gülleprobe eine Sockentupferprobe und drei Umgebungskotproben aus den Bereichen Vorwartehof und Haupttriebweg sowie aus dem Gruppenbereich mit Fress- und Liegeplätzen gewonnen wurden. All diese Proben wurden einzeln mittels bakterieller Kultur und Direkt-PCR untersucht. Zusätzlich wurde ein Pool aus Gülle und den übrigen drei Umgebungskotproben ebenfalls mittels Kultur und PCR untersucht. Außerdem wurden die im Rahmen von zwölf monatlichen Milchleistungsprüfungen gewonnenen Einzeltiermilchproben monatsweise zu 25er und 50er Pools zusammengefasst und mittels ELISA auf MAP-spezifische Antikörper untersucht. Mithilfe eines bayesianischen Modells wurden die kumulative Sensitivität und Spezifität für wiederholte Untersuchungen geschätzt, wobei die Kovarianzen zwischen den verschiedenen Tests und zwischen den wiederholten Tests berücksichtigt wurden. In Herden mit einer Prävalenz von mindestens 2 % MAP-Ausscheidern waren mindestens sieben Untersuchungen mittels Umgebungskotproben notwendig, um eine Sensitivität von 95 % zu erreichen. Um eine 95%ige Sensitivität in Herden mit einer Intra-Herden-Prävalenz von unter 2 % zu erzielen, war neben wiederholten Untersuchungen auch eine Kombination verschiedener Probenarten nötig.
In der vorliegenden Arbeit wurde gezeigt, dass MAP-infizierte Herden mit niedriger Intra-Herden-Prävalenz bei einmaliger Untersuchung mithilfe kostengünstiger Untersuchungsmethoden nicht ausreichend zuverlässig detektiert werden. Dennoch können Umgebungskotproben und gepoolte Einzelmilchproben für die Überwachung MAP-freier Milchviehherden eingesetzt werden, wenn die Untersuchungen wiederholt durchgeführt werden. Eine Kombination von Probenarten und/oder Labormethoden kann die Sensitivität erhöhen. In Mutterkuhherden oder Betrieben mit Stroheinstreu kann die Untersuchung von Pools aus zehn Einzeltierkotproben mittels bakterieller Kultur und/oder Direkt-PCR zur Anwendung kommen. Um MAP-freien Herden eine hohe Wahrscheinlichkeit der Freiheit von Paratuberkulose attestieren zu können, ist regelmäßiges wiederholtes Testen (mit MAP-negativen Ergebnissen) nötig. In the context of paratuberculosis control programs, it is important that MAP-infected herds are detected with the least possible costs, but with sufficient certainty. In the present work, various cost-effective approaches for herd diagnostics of paratuberculosis in cattle were evaluated. The suitability of the diagnostic approaches for detecting herds with a low prevalence of MAP shedders was also examined.
Herd diagnostics were evaluated in study 1 using pooled individual fecal samples of a random sample. An investigation of three herds with 300 animals each was simulated. Each herd was represented by 300 individual fecal samples previously tested for MAP. In order to reflect a different within-herd prevalence (1.00%; 2.00% and 4.33%), n MAP-positive fecal samples with n=3; 6; 13 and 300−n MAP-negative fecal samples were assembled. Ten random samplings were simulated for each herd by randomly selecting 80 samples from the 300 individual fecal samples, which were divided into pools of size 5 and 10. Pools with at least one MAP-positive sample were analyzed using bacterial culture and direct PCR. It was shown that there is a positive correlation between the bacterial density in a pool and the pool sensitivity (probability of detecting a pool with at least one MAP-positive fecal sample as a MAP-positive pool). No significant difference in pool sensitivity occurred when comparing pools of size 5 to pools of size 10. When using direct PCR, the pool sensitivity resulted in 47.0% for pools of size 5 and 45.9% for pools of size 10. The pool sensitivity of pools analyzed by bacterial culture did not deviate significantly from the pool sensitivity of pools analyzed by direct PCR; this was the case for both pools of size 5 and 10. It was shown that the combination of direct PCR and bacterial culture can significantly increase the sensitivity. If both laboratory methods were combined when analyzing pools of size 10, the herd sensitivity for analyzing pooled individual fecal samples of a random sample was between 67.3% and 84.8%. In herds with a low prevalence of MAP shedders, a single examination of pooled individual animal fecal samples from a random sample is not sufficient to detect the herd with high certainty.
In study 2, the suitability of repeated environmental samples and pooled milk samples for MAP diagnostics at herd level was evaluated, since even when using these inexpensive diagnostic approaches, a single examination is not sufficient to identify herds with low prevalence with high certainty. In 36 dairy herds housed in free stalls in Thuringia (federal state of Germany), twelve on-farm visits were carried out over a period of one year. At each on-farm visit, a liquid manure sample as well as a boot swab sample and three environmental samples were taken from the milking area, the main alleyway and the lactating cow floor. All of these samples were analyzed individually using bacterial culture and direct PCR. A pool of liquid manure and the other three environmental fecal samples was also analyzed using culture and PCR. In addition, individual milk samples, taken in the context of twelve dairy herd improvement tests, were pooled monthly into pools of size 25 and 50 and tested for MAP-specific antibodies using ELISA. A Bayesian model was used to estimate the cumulative sensitivity and specificity for repeated tests, taking into account the covariances between the different tests and between the repeated tests. In herds with a prevalence of at least 2% MAP shedders, at least seven sampling events were necessary to achieve a sensitivity of 95% using environmental samples. In order to achieve a sensitivity of 95% in herds having a within-herd prevalence of less than 2%, a combination of different sample types was necessary in addition to repeated samplings.
The present study showed that the detection of MAP-infected herds with a low within-herd prevalence using inexpensive testing schemes is not sufficiently reliable when testing herds only once. However, environmental samples and pooled milk samples can be used to monitor MAP-free dairy herds if testing is repeated. A combination of sample types and/or laboratory methods can increase the sensitivity. In suckler herds or farms with straw bedding, analysis of pools of ten individual fecal samples using bacterial culture and/or direct PCR can be used. In order to confirm that MAP-free herds have a high probability of freedom from paratuberculosis, the herds should be tested repeatedly with MAP-negative results.