Methoden zur Neuportionierung von Tiefgefrier-Sperma beim Rind und deren Einfluss auf die resultierende Qualität des Spermas

Ziel dieser Arbeit war es, TG-Sperma vom Bullen nachträglich in kleinere Portionen aufzuteilen und zu prüfen, ob diese in der In-vitro-Produktion (IVP) einsetzbar sind. Die nachträgliche Neuportionierung fand mittels zwei verschiedener Methoden statt. Bei den Sperm-Cuts wurden TG-Sperma-Straws, ohne dass das Sperma auftaut, in sechs ca. gleich große Stücke geschnitten. Bei der zweiten Methode, dem Refreezing, wurde das TG-Sperma aufgetaut, über einen Spermfilter aufbereitet und anschließend mit neuem Verdünner versetzt und wieder in flüssigem Stickstoff eingefroren. Hierbei entstanden aus einem Straw vier neue Portionen. Bei den Straw-Cuts wurden die Endstücke getrennt von den Mittelstücken betrachtet.
Nach dem Auftauen sowie nach der Aufbereitung der Straw-Cuts und der Refreezing-Straws wurden die Spermaqualitätsparameter Konzentration, Motilität und der Anteil der lebenden Spermien mittels eines CASA-Systems ermittelt. Es wurde auch der DNA-Fragmentations-Index (DFI) bei den unterschiedlichen Spermagruppen (direkt nach dem Auftauen und nach dreistündiger Inkubation) mittels Flow-Zytometer ermittelt, um eine Aussage über die Intaktheit der Spermien-DNA treffen zu können. Zusätzlich wurde das Sperma auch in drei IVP-Durchgängen in der IVF eingesetzt. Nach der IVP wurden an Tag 7 und 8 die Teilungs- und Entwicklungsraten erfasst.
Es wurden folgende Ergebnisse erzielt:
1.Die durchschnittliche Spermienkonzentration nach dem Auftauen lag bei den Straw-Cuts-Endstücken bei 38,5 ± 12,4 Mio/ml, bei den Straw-Cuts-Mittelstücken bei 34,5 ± 12 Mio/ml, bei dem Refreezing bei 4,1 ± 1,9 Mio/ml und bei der Kontrolle bei 40,7 ± 13 Mio/ml. Nach der Aufbereitung sank diese bei den Endstücken auf 3,7 ± 0,9 Mio/ml, bei den Mittelstücken auf 6,8 ± 2,8 Mio/ml, beim Refreezing auf 2,5 ± 0,5 Mio/ml und bei der Kontrolle auf 29,0 ± 10,2 Mio/ml.
2.Nach dem Auftauen betrug die Gesamtspermienmotilität bei den Endstücken 17,5 ± 3,9 %, bei den Mittelstücken 23,2 ± 3,6 %, beim Refreezing 7,1 ± 3 % und bei der Kontrolle 36,9 ± 1,6 %. Nach der Aufbereitung betrug diese bei den Endstücken 25,6 ± 3,8 %, bei den Mittelstücken 42,2 ± 10,5 %, beim Refreezing 8,2 ± 3,5 % und bei der Kontrolle 59,6 ± 2,2 %.
3.Der Anteil lebender Spermien nach dem Auftauen lag bei den Endstücken bei 21,3 ± 4,5 %, bei den Mittelstücken bei 25,8 ± 2,2 %, beim Refreezing bei 10,3 ± 8 % und bei der Kontrolle bei 41,3 ± 4,9 %. Nach der Aufbereitung stieg dieser Anteil bei den Endstücken auf 39,3 ± 6,4 %, bei den Mittelstücken auf 50,2 ± 12,1 %, beim Refreezing auf 15,1 ± 7,1 % und bei der Kontrolle auf 63,7 ± 4,5 %.
4.Der DFI zum Zeitpunkt 0 h betrug bei den Endstücken 4,3 ± 0,63 %, bei den Mittelstücken 4,0 ± 1,1 %, beim Refreezing 19,1 ± 5,2 % und bei der Kontrolle 3,05 ± 0,8%. Zum Zeitpunkt 3 h betrug dieser bei den Endstücken 9,8 ± 1,5 % bei den Mittelstücken 8,0 ± 2,1 %, beim Refreezing 25,5 ± 5,4 % und bei der Kontrolle 7,2 ± 0,6 %.
5.In der IVP stellte sich bei den Embryonen nach IVF mit Sperma aus den Endstücken eine Teilungsrate von 25,3 ± 8,3 % und eine Entwicklungsrate von 0 % dar. Bei den Embryonen mit Sperma aus den Mittelstücken zeigte sich eine Teilungsrate von 43,5 ± 11 % und eine Entwicklungsrate von 1,7 ± 1,2 %. Bei den Embryonen mit Sperma aus dem Refreezing betrug die Teilungsrate 25,6 ± 5,4 % und die Entwicklungsrate 0,8 ± 1,1 %. Die Embryonen mit Sperma aus der Kontrolle weisen eine Teilungsrate von 78,9 ± 1,5 % und eine Entwicklungsrate von 30,7 ± 6,7 % auf.
In der vorliegenden Arbeit wurde erstmals eine Neuportionierung in kleinere Volumina von bereits gefrorenem Sperma untersucht und anschließend in der IVP verwendet. Aus den Ergebnissen der Gesamtspermienmotilität, dem Anteil lebender Spermien, dem DFI und den Teilungs- und Entwicklungsraten aus der IVP lässt sich schlussfolgern, dass sich beide Methoden nicht dazu eignen, für die IVP verwendet zu werden. Es können damit keine zufriedenstellenden Ergebnisse erzielt werden. Das Herabsetzen der Spermienkonzentration vor dem zweiten Einfrierprozess wurde bewusst durchgeführt, jedoch ist diese Reduktion teilweise sehr stark. Möglicherweise können beide Methoden der angefertigten Arbeit optimiert werden, indem weniger Portionen aus dem gewonnenen Sperma hergestellt werden. Eine weitere Möglichkeit ist es, zu testen, ob die Spermien deutlich besser vor den Schäden durch die Kryokonservierung geschützt werden können. Methods for new ways of splitting cryopreserved bull sperm and the effects on the resultant quality of the sperm
The aim of this work was to split cryopreserved bull sperm in smaller portions and to check if these can be used in In-vitro-Production (IVP). The splitting was tested with two methods. Sperm-cuts (first method) were made out of a straw which was then cut in six equal pieces. For the second method (refreezing) cryopreserved sperm was thawed, processed, mixed with new extender and frozen again. During this process, four new portions were obtained. Straw-cut endpieces were analyzed separately from midpieces.
After thawing and processing, the following parameters of sperm quality, i.e. sperm concentration, total sperm motility and the percentage of living sperm, were measured. Furthermore, the DNA-Fragmentation-Index (DFI) following different kinds of sperm treatments (directly after thawing and after three hours of incubation) was analyzed, to draw a conclusion about the sperm DNA. Additionally, the sperm was used in three IVP sessions. At day 7 and 8 after IVF, the cleavage and development rates were recorded.
The following results could be obtained:
1.The average sperm concentration after thawing were for the endpieces 38.5 ± 12.4 mio/ml, for the midpieces 34.5 ± 12.0 mio/ml, for the refreezing 4.1 ± 1.9 mio/ml and for the control group 40.7 ± 13.0 mio/ml. After processing, the concentration decreased for the endpieces to 3.7 ± 0.9 mio/ml, for the midpieces to 6.8 ± 2.8 mio/ml, for the refreezing to 2.5 ± 0.5 mio/ml and for the control group to 29.0 ± 10.2 mio/ml.
2.After thawing, the average total sperm motility for the endpieces was 17.5 ± 3.9 %, for the midpieces 23.2 ± 3.6 %, for the refreezing 7.1 ± 3.0 % and for the control group 36.9 ± 1.6 %. After processing the measured value for the endpieces was 25.6 ± 3.8 %, for the midpieces 42.2 ± 10.5 %, for the refreezing 8.2 ± 3.5 % and for the control group 59.6 ± 2.2 %.
3.After thawing the percentage of living sperm for the endpieces was 21.3 ± 4.5 %, for the midpieces 25.8 ± 2.2 %, for the refreezing 10.3 ± 8.0 % and for the control group 41.3 ± 4.9 %. After the processing it increased for the endpieces to 39.3 ± 6.4 %, for the midpieces to 50.2 ± 12.1 %, for the refreezing to 15.1 ± 7.1 % and for the control group to 63.7 ± 4.5 %.
4.DFI results at time point 0 h was for the endpieces 4.3 ± 0.6 %, for the midpieces 4.0 ± 1.1 %, for the refreezing 19.1 ± 5.2 % and for the control group 3.1 ± 0.8 %. At time point 3 h the value was for the endpieces 9.8 ± 1.5 %, for the midpieces the value was 8.0 ± 2.1 %, for the refreezing the value was 25.5 ± 5.4 % and for the control group the value was 7.2 ± 0.6 %.
5.When the sperm were used for IVP the cleavage rate was for the endpieces 25.3 ± 8.3 % and the developmental rate 0%. The cleavage rate was for the midpieces 43.5 ± 11.0 % and the developmental rate 1.7 ± 1.2 %. The cleavage rate was for the refreezing 25.6 ± 5.4 % and the developmental rate 0.8 ± 1.1 %. The cleavage rate of the control group was 78.9 ± 1.5 % and the developmental rate 30.7 ± 6.7 %.
In this work the splitting of cryopreserved sperm in smaller portions and the use of this sperm for IVP was tested for the first time. The results of total sperm motility, the percentage of living sperm, the DFI and the cleavage and developmental rates show that both methods cannot be recommended for the use in IVF. If the sperm will be used in the IVP the results will be none satisfying. The decrease of the sperm concentration before the second freezing on one hand was made on purpose, but on the other hand it is sometimes very high. Both methods could possibly be optimized by making less portions than four or six. Another possibility is to test whether the sperm cells could be protected more from the damage during the cryopreservation.