Genetic variability of bovine milk proteins and their associations with health and growth parameters of pre weaned beef and dairy calves

Genetische Variabilität in Nutztierpopulationen ist entscheidend für die Anpassung an zukünftige Veränderungen (z. B. Klima, Marktanforderungen) sowie für das Erreichen von Zuchtfortschritt. Daher war es ein Ziel dieser Arbeit, die Variabilität der vier Kaseine, die mit 80 % den Hauptanteil der Milchproteine einnehmen, in unterschiedlichen Selektionslinien deutscher Rinderrassen zu untersuchen. Aufgrund ihres Einflusses auf ökonomisch wichtige Leistungsmerkmale (u. a. Milchmenge) und darüber hinaus auf verarbeitungstechnische Eigenschaften der Milch, eignen sich Milchproteinpolymorphismen als wertvolles Instrument zur Abbildung von Selektion.
Insbesondere durch ihren positiven Einfluss auf die Milch- und Proteinmenge, die während der Säugeperiode einen entscheidenden Faktor für das Wachstum von Mastkälbern darstellen, haben Milchproteinpolymorphismen auch in der Fleischrinderzucht an Bedeutung gewonnen. Auf Basis dieser Erkenntnisse war es ein weiterführendes Ziel, den Einfluss von maternalen Milchproteingenotypen auf die Wachstumsentwicklung von Mastkälbern zu analysieren.
Zunehmend wird auch ein Nutzungspotential von Milchproteinpolymorphismen in der funktionellen Ernährung beschrieben, wobei insbesondere bioaktive Peptide Beachtung finden. Aktuell am häufigsten diskutiert sind die gesundheitlichen Vorteile der ursprünglichen A2 Variante des β-Kaseins im Vergleich zur A1 Variante, die im Laufe der Evolution durch eine Mutation entstanden ist. Im Fokus dieser Argumentation steht das opioid-wirkende Peptid β Casomorphin-7 (β CM7), das hauptsächlich bei der Hydrolyse von A1 β Kasein freigesetzt und mit Folgen für die Gesundheit diskutiert wird. Basierend auf diesem Hintergrund wurde ein In vivo-Versuch durchgeführt, in dem neugeborene Kälber mit ausschließlich A1- oder A2 Milch getränkt wurden. Mögliche Auswirkungen der unterschiedlichen Milchvorlage im Hinblick auf die Freisetzung des Peptids β-CM7 wurden anhand von Wachstums- und Gesundheitsindikatoren (u. a. Körperkerntemperatur, Kotkonsistenz) sowie erstmals anhand von Plasmakonzentrationen von β-CM7 erfasst. Diese Ergebnisse bieten weiterführend eine Basis für zukünftige Humanstudien hinsichtlich neuer Perspektiven im Bereich ‚Functional Foods‘.
Auf Grundlage dieser Untersuchungen beleuchtete die Arbeit abschließend das Potential, bovine Milchproteinpolymorphismen als mögliches zukünftiges züchterisches Instrument zu nutzen. Dabei wurde insbesondere auf züchterische Strategien zur Umstellung auf eine reine A2-Herde sowie auf Herausforderungen der marker-gestützten Selektion eingegangen.
Aufgrund dieser unterschiedlichen Aufgabestellungen sowie Datensätzen im Hinblick auf Milchproteinpolymorphismen wurde die vorliegende Arbeit in verschiedene Kapitel unterteilt. Um an das Dissertationsprojekt heranzuführen, dient Kapitel 1 der allgemeinen Einleitung. Zu Beginn wurde dabei die Bedeutung von boviner Milch für die menschliche Ernährung aber auch für die Versorgung neugeborener Kälber hervorgehoben. Im weiteren Verlauf wurde speziell auf die Eigenschaften und Funktionen der vier Kaseine eingegangen.
Kapitel 2 befasst sich mit einer Diversitätsanalyse boviner Milchproteinpolymorphismen auf Basis individueller Selektionslinien innerhalb der Rinderrassen Holstein Friesian (HF), Deutsches Schwarzbuntes Niederungsrind (DSN) und Deutsches Fleckvieh (GS). Ob die unterschiedliche Gewichtung von Merkmalen in den einzelnen Zuchtrichtungen (z. B. Zucht auf Weideeignung) bereits Auswirkungen auf die Allelfrequenzen von Genen hat, die unter Selektionsdruck stehen, sollte am Beispiel der Milchproteine untersucht werden. Die Identifizierung der genetischen Varianten der Milchproteine αS1-, αS2-, β-, und κ-Kasein erfolgte mittels biochemischer Methoden. Die Ergebnisse deuten auf unterschiedliche Zuchtstrategien in Produktionssystemen mit und ohne Weidehaltung hin. Ein höherer Anteil des κ-CN B Allels ist bei HF-Populationen mit Weidegenetik im Gegensatz zur Referenzpopulation aus Stallhaltungssystemen zu verzeichnen. Für die Milcherzeugung auf Grünland werden Rassen benötigt, die eine optimale Eignung für die Haltung auf Dauergrünland aufweisen und die genetischen Voraussetzungen haben, Milch zu produzieren, die den heutigen Anforderungen der Verbraucher entspricht. Die Vorherrschaft der Variante B (κ CN) könnte demnach ein Ergebnis der indirekten Selektion auf Weideeignungsmerkmale sein.
Ein Vergleich zwischen aktuellen und historischen Daten zeigt deutliche Verschiebungen der Allelfrequenzen und unterstreicht somit, dass die Kaseine Selektionsmechanismen unterliegen. Steigende Allelfrequenzen konnten vor allem für die Allele A2 (β-CN) und B (κ CN) beobachtet werden, wobei niedrig-frequentierte Allele wie z. B. αs1-CN A und αs2-CN D nicht nachgewiesen werden konnten. Dieser Verlust von Allelen an einem Genort geht mit abnehmender Diversität einher und suggeriert ein regelmäßiges Monitoring der Milchproteinpolymorphismen.

Auf Basis der Erkenntnisse, dass Milchproteinpolymorphismen einen Einfluss auf die Milchzusammensetzung (u. a. Milchproteingehalt) sowie auf die Ernährungsphysiologie des Menschen haben, wurden in Kapitel 3 Assoziationen zwischen der (Mutter-)Milch unterschiedlicher Kaseingenotypen und der Gewichtsentwicklung von Fleischkälbern untersucht. Hierbei wurden das Geburtsgewicht, die täglichen Zunahmen sowie das Absetzgewicht nach einer Säugezeit von 180 Tagen von Kälbern der Rassen Deutsch Angus (GA) und GS erfasst. Neben dem Einfluss individueller Kaseingenotypen (αs1-, β-, αs2-, und κ CN) wurden bei der Anwendung linearer gemischter Modelle auch gekoppelte αs1 β αs2 κ CN Genotypen (Reihenfolge der Gene auf BTA6) betrachtet, um die Effekte des gesamten Kaseinclusters unter Berücksichtigung von Interaktionseffekten abzubilden. Höhere tägliche Zunahmen und ein höheres Absetzgewicht konnte für Kälber, die an Mutterkühen mit dem Genotyp BB für jeweils αs1-CN und κ-CN gesäugt haben, verzeichnet werden (P < 0.05). So wiesen z. B. Kälber nach Aufnahme von Milch des Genotyps BB (κ-CN) im Vergleich zu den Genotypen AB und AA (beide 204 kg) mit 215 kg ein signifikant höheres Absetzgewicht auf. Der β-CN Genotyp zeigte ausschließlich einen Effekt auf das Geburtsgewicht von Kälbern. Da das Geburtsgewicht nicht von der Milchaufnahme abhängig ist, wird eine Kopplung der Kaseinloci mit Genomsegmenten, die mit fetalem Wachstum assoziiert sind, vermutet. Unter Beachtung von Interaktionseffekten führte der Verzehr von Milch des kombinierten Genotyps BB|A2A2|AA|AB (αs1-ǀβ-ǀαs2-ǀκ-CN) zu höheren Zunahmen sowie zu höheren Absetzgewichten, im Vergleich zu den anderen kombinierten Genotypen (P < 0.05). Der vorteilhafte Effekt des Genotyps BB|A2A2|AA|AB könnte aus anderen Quantitative Trait Loci (QTL) für Körpergewicht hervorgehen, die sich im Kopplungsungleichgewicht mit den Kaseingenen befinden. Basierend auf diesen Ergebnissen konnte der Einsatz von Milchproteinpolymorphismen als wertvolles Instrument in der Futterprogrammierung von Kälbern identifiziert werden. Hohe Zunahmen in den ersten Lebenswochen von Kälbern bilden die Voraussetzung für eine gute Konstitution, ein niedriges Erstkalbealter und hohe Zunahmen bei Masttieren. Auf diese Weise können Züchter und Tierhalter gezielt Mutterkühe selektieren, die den Genotypen aufweisen, um die postnatale Gewichtsentwicklung von Kälbern zu verbessern.
Der in Kapitel 4 aufgeführte In-vivo Versuch diente zur Analyse der Effekte der Aufnahme boviner Milch mit unterschiedlichen β-Kaseinvarianten (A1- vs. A2-Milch) auf die Entwicklung und Gesundheit von neugeborenen Kälbern aus Milchproduktionssystemen. Hierbei handelte es sich um ein Kooperationsprojekt zwischen den Universitäten Ludwig-Maximilians-Universität München und Justus-Liebig-Universität Gießen, welches am Lehr- und Versuchsgut Oberschleißheim durchgeführt wurde. Als Grundlage für diesen Versuch dienten Studien, die bereits nachweisen konnten, dass der Konsum von A1-Milch und damit die Aufnahme des opioid-wirkenden Peptides β casomorphin-7 (β-CM7) zu entzündlichen Reaktionen im Darm von Mäusen und Ratten sowie zu einer unregelmäßigen Atmung bis hin zum Atemstillstand führte. Im genannten Fütterungsversuch wurden 47 neugeborene Kälber die ersten drei Lebenswochen mit unterschiedlichen β-Kaseinvarianten in der Vollmilch getränkt (A1- vs. A2-Milch). Parallel dazu wurden Gesundheitsparameter (Atemfrequenz, Körperkerntemperatur, Kotbonitur) sowie die Gewichtsentwicklung dokumentiert. Unter der Berücksichtigung von externen Umweltfaktoren (u. a. Geschlecht) in linearen gemischten Modellen, ergaben sich für die beiden Fütterungsgruppen ausgeprägte Unterschiede hinsichtlich der täglichen Milchaufnahme sowie der Kotbonitur. Kälber, die ausschließlich A2-Milch aufnahmen, zeigten eine deutlich weichere Kotkonsistenz und darüber hinaus ein vermehrtes Durchfallaufkommen. Beide Fütterungsgruppen zeigten in den Wachstumsparametern (tägl. Zunahmen, Endgewicht) keine Unterschiede. Dies induziert, dass A2-Milch den höheren Nährstoff- und Wasserverlust aufgrund des häufigeren Durchfalls sowie die geringere Milchaufnahme aufgrund des höheren Milchproteingehalts kompensieren kann.
Im Zuge dieses Fütterungsversuches ist es außerdem erstmals gelungen, intaktes β CM7 im Plasma von Kälbern nachzuweisen. Dafür wurden jeweils drei Blutproben von den betrachteten Kälbern entnommen. Die Blutentnahmen erfolgten direkt nach der Geburt, sowie an den Lebenstagen 3 und 21. Repräsentative Plasmaproben wurden im Labor des Instituts für Tierzucht und Haustiergenetik (JLU Gießen) mittels einem Enzyme-linked Immunosorbent Assay (ELISA) auf β-CM7 untersucht. Direkt nach der Geburt und damit vor der ersten Kolostrum- bzw. Kaseinaufnahme konnte kein β CM7 im Plasma der Kälber identifiziert werden. In den zwei darauffolgenden Blutentnahmen konnte in beiden Fütterungsgruppen intaktes β-CM7 gemessen werden. Es zeigte sich jedoch eine 5-mal höhere Konzentration an β CM7 im Plasma von A1-Kälbern verglichen mit Kälbern, die reine A2-Milch über drei Wochen aufgenommen haben.

Abschließend dient Kapitel 5 einer allgemeinen Diskussion, die die wichtigsten Erkenntnisse sowie forschungsrelevante Ergebnisse der vorherigen Kapitel vor dem Hintergrund der aktuellen züchterischen Entwicklung betrachtet. Darüber hinaus wird ein Ausblick bezüglich zukünftiger Selektionsentscheidungen, Trends und Möglichkeiten in der Nutzung von Milchproteinpolymorphismen in der Rinderzucht gegeben. Genetic variation in farm animal populations is critical for the adaptation to future changes in climate and consumer demand, as well as for continual genetic improvement of economically important traits. Hence, one aim of this study was to analyze the variability of the caseins, which account for 80% of the total milk proteins, in divergent selection lines of German cattle breeds. Due to their influence on economic important production traits (i.e., milk yield) and moreover on technological properties of milk, milk protein polymorphisms are a valuable tool to detect selection.
In particular, due to their positive impact on milk yield and protein content of milk, milk protein polymorphisms have also gained in importance in beef cattle, as these factors are directly linked to the growth rate of suckling beef calves. Based on this knowledge, a further aim was to analyze the effects of maternal milk protein genotypes on the growth performance of beef calves.
Even more often, milk protein variants are associated as a potential object of functional nutrition, whereby particularly casein-derived bioactive peptides are of special importance. At present, there is an ongoing debate of the health-promoting benefits of the original A2 variant of β-casein (β CN) in comparison to the A1 variant caused by a point mutation during evolution. The focus of this argumentation is on the opioid peptide β-casomorphin-7 (β CM7), which is mainly released by digestion of the A1 variant and may be a serious risk factor in the etiology of human diseases. Against this background, an in vivo study was conducted, in which neonatal calves were fed exclusively with pure A1- or A2 milk. Possible effects of these alternative milk feedings are recorded by several growth and health parameters (i.e., body temperature, fecal score) as well as by plasma levels of β-CM7. These findings will also have an impact on human health by contributing new prospects to the field of functional foods and pharmaceutical products.
On the basis of these investigations, the present study finally highlights the potential of bovine milk protein polymorphisms as a future tool for breeding activities. Especially diverse breeding strategies for the herd conversion into the favorable A2 genotype as well as the challenges of marker assisted selection are given.

As it can be seen here, the present study covers various aspects of milk protein polymorphisms including different data sets. Therefore, the structure of this work is divided into a set of chapters. In order to introduce to the overall topic, chapter 1 serves as a general introduction. Accordingly, the importance of bovine milk in human nutrition but also as the main source for neonatal calves is highlighted. Furthermore, information about the function and properties of especially the four main milk proteins - the caseins - was provided.
Chapter 2 addresses the genetic diversity and population structure in divergent selection lines within the German cattle breeds Holstein Friesian (HF), German Black Pied cattle (DSN) and German Simmental (GS) on the basis of milk protein polymorphisms. Whether the different weighting of traits in individual breeding goals (i.e., pasture ability) already has an impact on allele frequencies of loci under selection, should be analyzed through the example of milk protein polymorphisms. Simultaneous typing of genetic variants of the milk proteins αs1-casein (αs1 CN), β-casein (β CN), αs2 casein (αs2 CN) and κ casein (κ-CN) was carried out on skimmed milk by isoelectric focusing. Allele and haplotype frequency distributions indicate different breeding strategies in production systems with or without grazing. For instance, the pasture-based HF selection lines displayed significant higher allele frequencies for the favorable κ CN B allele in comparison to the HF reference population kept indoors. In grazing systems, the focus of selection has emphasized fertility, fitness and robustness. Thus, the prevalence of the B allele (κ CN) in pasture-based selection lines may be the result of an indirect selection for these traits.
The comparison between present results and historic data reveals noticeable changes in allele frequencies reflecting that casein loci or moreover selected mutations in close proximity to the caseins underlie selective breeding. Increasing frequencies were especially observed for the alleles β-CN A2 and κ-CN B, whereas low-frequent alleles like αs1-CN A and αs2-CN D could not be identified. This loss of alleles goes along with a decreasing diversity at the casein loci and suggests a continual monitoring of the milk protein variability.

Based on the knowledge that milk protein polymorphisms are related to milk composition (e.g., protein content), chapter 3 covers the impacts of maternal casein genotypes on growth traits of their suckling calves. Birth weight, average daily weight gains (ADG) and the age-adjusted weaning weight at 180 days of life (WW180) were recorded for calves of the breeds German Angus (GA) and GS. Linear mixed models were used considering either separate fixed effects of individual casein loci or composite αs1-β-αs2-κ-CN genotypes (order of genes on BTA6) to include interactions among single loci (i.e., epistatic effects). Greater ADG and WW180 were observed for calves from dams with the genotypes κ CN BB and αs1 CN BB, respectively (P < 0.05). For example, WW180 was greater for calves from dams carrying the κ-CN genotype BB (215 kg) compared to calves representing the maternal AB and AA genotypes (both 204 kg). Allowing for epistatic effects, the composite casein genotype BBǀA2A2ǀAAǀAB (αs1-ǀβ-ǀαs2-ǀκ-CN) was associated with greater ADG and WW180 of calves (P < 0.05). The favorable effect of the composite genotype BB|A2A2|AA|AB on growth traits (ADG and WW180) may be caused by other quantitative trait loci (QTL) for body weight, being in linkage disequilibrium with the casein genotype. Such pronounced genetic impact of selectable casein genotypes offers new perspectives for breeding strategies aiming on improvements of pre-weaning calf performance due to the nutritional value of colostrum or milk. Hence, selection on favorably associated casein genotypes might contribute to economic efficiency through a shortened fattening period and reduced feeding costs.

The in vivo study referred to chapter 4 serves to analyze comparative effects of milk containing A1 versus A2 β-CN on health and growth of neonatal dairy calves. This research was based on several studies indicating health impairing effects (i.e., apnea, inflammatory response) of the A1-derived opioid peptide β CM7. In total, forty-seven neonatal calves of the breeds German Holstein (GH), GS and their crossing (GH × GS) were fed either homozygote A1- or homozygote A2-milk during their first three weeks of life. Fecal score (FS), respiratory frequency, and rectal body temperature were recorded daily, whereas body weight was measured at birth and at day 21 to estimate ADG. In consideration of environmental influences (i.e., sex) in linear mixed models, marked differences in daily milk intake and fecal consistency were observed between both feeding groups. Fecal consistency was softer for calves fed A2 milk (P < 0.05). While 44% of A2 calves had diarrhea or revealed a tendency towards it (FS ≥ 3), A1-calves had a prevalence of 21%. Nevertheless, similar ADG and end weights of calves fed A1- or A2-milk (P > 0.05) indicate that A2 milk may compensate higher diarrhea rates and lower daily milk intake due to a higher protein content.
In the course of this feeding study, blood was collected from calves three times during the experimental period. For the first time, the respective plasma samples were analyzed for intact β-CM7 via an enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). Intact β-CM7 was detected in plasma of both feeding groups, while the concentration of β-CM7 in plasma of calves fed A1-milk was 5 times higher than in plasma of calves fed A2-milk. Evidence from this study suggests that, due to the change in the amino acid sequence, A2 milk in animals and probably in humans might be able to prevent or, at least, to minimize the cleavage of β-CM7.

At last, chapter 5 completes the whole thesis with a general discussion on all themes covered and analyzed. Against the background of the current breeding development, an outlook is given to future selection decisions, trends and the potential of the usage of milk protein polymorphisms in cattle breeding.