Die Effekte von Intermedin/Adrenomedullin 2 auf die Integrität des Alveolarepithels während des akuten Atemnotsyndroms

Die Aufrechterhaltung des Flüssigkeitsgleichgewichtes im Alveolarraum der Lunge durch aktiven Transport von Natrium durch die basolateral in den Alveolarepithelzellen befindliche Na+-K+-ATPase ist essentiell für den optimalen Gasaustausch. Ein Kennzeichen des akuten Atemnotsyndroms (Acute Respiratory Distress Syndrome, ARDS) ist die Ansammlung proteinreicher Ödemflüssigkeit im Alveolarraum, welche durch Störung des Flüssigkeitsgewichtes zu einer massiven Einschränkung des Gasaustausches führt. Die daraus resultierende Hypoxämie und damit die Notwendigkeit von künstlicher Beatmung sind ebenfalls charakteristisch für das akute Atemnotsyndrom, welches trotz neuester Erkenntnisse in der Behandlung in den meisten Studien zu einer Mortalität von 30-40% führt. Eine beeinträchtigte alveoläre Clearance spielt die entscheidende Rolle für das Weiterbestehen des alveolären Ödems, wobei eine schnelle Auflösung mit einer reduzierten Mortalität korreliert.
Tier- und Organmodelle zur Beseitigung des nicht kardiogen bedingten Lungenödems als Charakteristikum des ARDS haben sich als unersetzlich in der Entwicklung von neuen Therapiestrategien zur Verbesserung der alveolären Clearance erwiesen. Für die vorliegende Arbeit wurde eine neue Methode entwickelt, die es möglich macht, die Funktion der alveolokapillären Barriere in Echtzeit in isolierten, perfundierten und ventilierten Mauslungen zu erfassen.
In diesem zuerst zu etablierenden Versuchsaufbau wurde die Wirkung des in 2004 entdeckten und isolierten Peptides Intermedin/Adrenomedullin 2 (IMD/AM2) auf das Alveolarepithel und den alveolären Flüssigkeitstransport untersucht. Zusätzliche Experimente auf molekularer Ebene mit Alveolarepithelzellen (ATII-Zellen) wurden parallel durchgeführt, um die Auswirkungen des Einsatzes von IMD/AM2 auf das Alveolarepithel näher zu beleuchten und die in der isolierten Mauslunge beobachteten Ergebnisse zu verifizieren.
Die Applikation von zusätzlicher Flüssigkeit in den Alveolarraum der isolierten Mauslunge mit Hilfe eines Mikrosprayers in Anwesenheit von pharmakologischen Modulatoren des Natriumtransportes und die anschließende Applikation der radioaktiven Tracer 22Na und [3H] Mannitol diente zur Charakterisierung des aktiven und passiven Flüssigkeitstransportes. Durch Anwendung geeigneter Inhibitoren der Signalmoleküle des vermutlich beteiligten cAMP-Signalweges in der Mauslunge konnten Rückschlüsse auf eine Aktivierung dieses Signalweges durch IMD/AM2 gezogen werden.
Unter Kontrollbedingungen wurden nahezu 62% des applizierten 22Na während des Beobachtungszeitraums von 60 Minuten aus dem Alveolarraum entfernt. Die alveoläre Flüssigkeitsclearance wurde durch Amilord und Ouabain signifikant gehemmt und durch Applikation der -Agonisten Terbutalin und Isoproterenol signifikant erhöht, wobei der Transit des Markers für die parazelluläre Permeabilität, [3H]Mannitol, unbeeinflusst blieb. Unter Kontrollbedingungen wurde ein ELF-Volumen (epithelial lining fluid; VELF) von 27.4 ± 4.9 µl gemessen. Eine signifikante Erhöhung des Flüssigkeitsgehaltes im Alveolarraum konnte in Anwesenheit sowohl von Amilorid, als auch Ouabain beobachtet werden, während eine Reduktion in Zusammenhang mit der Anwendung von Terbutalin und Isoproterenol auftrat. Diese Ergebnisse stehen mit den Daten, die durch die Anwendung des Nass-zu Trockengewicht-Verhältnisses des Lungengewebes gewonnen wurden, in direktem Zusammenhang.Durch IMD/AM2 konnte eine - mit der von Isoproterenol vergleichbare - Beschleunigung des alveolären Flüssigkeitstransportes induziert werden, die durch die Anwendung eines Inhibitors der cAMP-abhängigen Proteinkinase A (H-89) gehemmt werden konnte. Mit dem Adenylatzyklaseinhibitor SQ 22536 wurde hingegen eine deutliche Verringerung der basalen Na+ -Clearance hervorgerufen, die nicht durch Einsatz von Intermedin beeinflusst werden konnte. Mittels Biotinylierung ließ sich eine durch IMD/AM2 hervorgerufene, signifikante Erhöhung der α-Untereinheit der Na+-K+-ATPase in der Zellmembran der ATII-Zellen nachweisen, die durch entsprechende Anwendung von H-89, ebenfalls auch durch Einsatz des Adenylatzyklaseinhibitors SQ 22536, verhindert werden konnte.
Diese neue Messung von Tracer- und Flüssigkeitsbewegung über das Lungenepithel von Mäusen in Echtzeit ist eine praktikable Technik, um die Eigenschaften der alveolokapillären Barriere in gesunden Lungen zu erfassen. Die mögliche Nutzung von knock-out Mäusen in diesem System kann dazu beisteuern, neue Mechanismen zu identifizieren, welche die Formation und Auflösung des pulmonalen Ödems regulieren. Durch den Einsatz von Intermedin in dem für diese Arbeit neu etablierten System der isolierten, ventilierten und perfundierten Mauslunge konnte eine deutliche Beschleunigung der alveolären Clearance erreicht werden. Eine Beteiligung der Proteinkinase A und der Na+-K+-ATPase als Komponenten des klassischen cAMP-Signalweges scheint sicher, wobei eine cAMP- unabhängige Aktivierung der Proteinkinase A als mögliche Alternative zu dem klassischen cAMP- Signalweg bereits beschrieben wurde. Inwieweit Intermedin/Adrenomedullin 2 einen Einfluss auf diesen Signalweg hat, bedarf der weiteren Erforschung und eröffnet ein weiteres interessantes Forschungsfeld.
IMD/AM2, das jüngste Mitglied der Kalzitonin-Peptid Familie, scheint auf Grundlage dieser Arbeit eine wichtige Rolle in der weiteren Erforschung von Therapiekonzepten zur Auflösung des alveolären Ödems bei Patienten mit ARDS zu spielen. Maintaining alveolar fluid balance by active sodium transport is essential for optimal gas exchange. A hallmark of the acute respiratory distress syndrome (ARDS) is the accumulation of protein-rich edema fluid in the alveolar compartment of the lung. The resulting hypoxemia and the need for artificial ventilation strategies are also characteristic for ARDS, which cause a mortality of 30-40 % in the most studies despite knowledge of new therapeutic strategies. Impaired alveolar fluid clearance is a key underlying cause of alveolar fluid persistence and the ability of ARDS patients to clear edema fluid is correlated with reduced mortality.
Animal and organ models of edema resolution and ARDS have proved irreplacable in the development of novel therapeutic strategies that augment alveolar fluid clearance (AFC). Here we set out to establish a new method to investigate alveolar barrier function in real-time in isolated, ventilated and perfused mouse lungs.
Intermedin/Adrenomedullin2 was isolated for the first time in the year 2004 and in this work we establish a role of this new peptide in alveolocapillary barrier function. Additional experiments in alveolar epithelial cells (ATII cells) were done to highlight the impact of intermedin on the alveolar epithel and and the alveolar fluid transport and to verify the results we get in the model of the isolated mouse lung. Depositing excess liquid into the alveolar space by a microsprayer in the presence of pharmacological modulators of sodium transport and a subsequent delivery of 22Na and [3H] mannitol were applied to characterise active and passive fluid and small solute transport. Using specific inhibitors of the classical cAMP-pathway in the isolated mouse lung allows us to draw conclusions from these results about the consequences of using Intermedin for this pathway.
Approximately 62 % of the deposited 22Na was removed from the alveolar space within 60 min. 22Na clearance was significantly reduced by amiloride and ouabain and enhanced by terbutaline or isoproterenol, while transit of [3H] mannitol remained unaffected. Under control conditions, a VELF of 27.4 ± 4.9 µl was measured. A significant fluid retention was observed in the presence of amiloride and ouabain after excess liquid was deposited into the alveolar space, whereas a marked reduction in alveolar edema was detected after terbutaline or isoproterenol treatment. These results are in line with our wet-to- dry data.
The use of intermedin resulted in an isoproterenol-like increase of the alveolar fluid clearance. The adenylatecyclase inhibitor SQ 22536 and the proteinkinase A inhibitor H-89 caused a significant decrease of alveolar fluid clearance. Intermedin treatment resulted in an increase of the α- subunit of Na+-K+-ATPase in the membrane of ATII cells as assessed by biotinylation and streptavidin pull-down. This increase could not be seen using H-89 and the adenylatecyclase inhibitor SQ 22536.
Using IMD/AM2 in this new esthablished system of an isolated, ventilated and perfused mouse lung showed a marked increase of alveolar fluid clearance. This increase seems to be dependent on activation of PKA and Na+-K+-ATPase. A cAMP- independend pathway is also described, but if there is an influence of Intermedin/Adrenomedullin 2 needs further investigation.
In conclusion, this novel, real-time measurement of tracer and lung liquid movement is a feasible technique to accurately assess alveolar epithelial barrier properties in intact lungs. Using knock-out animals in this system may help in identifying novel mechanisms that regulate formation and clearance of pulmonary oedema. Intermedin, a member of the calcitonin-peptide family, may play an important role in the research for new therapeutic concepts resolving alveolar edema in patients with ARDS.