Flüssigkonservierung boviner Embryonen als Alternative zur Kryokonservierung

Flüssigkonservierung boviner Embryonen als Alternative zur Kryokonseriverung
Das Ziel der vorliegenden Arbeit war es, ein Flüssigkonservierungsmedium zu entwickeln, welches es bioptierten in vitro produzierten bovinen Embryonen ermöglicht, für sieben Tage bei Temperaturen zwischen 0-4 °C zu überleben und ihre Entwicklungsfähigkeit zu behalten. Für die Umsetzung erfolgte in dem zweistufigen Versuchsaufbau zunächst in 68 IVP-Durchgängen, mit dem Einsatz von 10675 Kumulus-Oozyten-Komplexen, die Gewinnung von insgesamt 1211 Morulae. Die ausgewählten Morulae wurden an Tag 6 der Kultur entnommen, bioptiert und anschließend alle für weitere 24 Stunden kultiviert. An Tag 7 erfolgte die Flüssigkonservierung der Embryonen in TCM199 mit den Proteinzusätzen BSA (1 mg/ml und 10 mg/ml), FBS (25 % und 50 %), FBS mit 0,1 % BSA (25 % und 50 %) und AFP Typ III mit 25 % FBS (1 mg/ml und 10 mg/ml) für 168 h. Eine Kontrollgruppe nicht-bioptierter Embryonen wurde unter den gleichen Bedingungen konserviert. Im Anschluss an die FK wurde anhand der Lebend-Tot-Färbung mittels Ethidium homodimer und Hoechst 33342 die Gesamtzellzahlen und die Lebend-Tot-Ratio bestimmt, sowie nach weiteren 72 h Kultivierung die Reexpansions- und Schlupfraten dokumentiert. Anhand dieser Ergebnisse erfolgte in der zweiten Stufe die Untersuchung der FK mit dem vielversprechendsten Konservierungsmedium an in vivo generierten Embryonen. Die Biopsie der an Tag 6 gespülten und als transfertauglich eingestuften Morulae erfolgte auch hier an der Hälfte der Embryonen. Ebenso wurde die Überlebensfähigkeit der Embryonen nach der FK anhand der Schlupfraten, der Gesamtzellzahl und der Lebend-Tot-Ratio gemessen. Es konnten folgende Ergebnisse erzielt werden:
1.An Tag 6 wurde eine durchschnittliche Teilungs- und Entwicklungsrate von 52,0 % und 19,3 % erreicht. Es entstanden insgesamt 2056 Embryonen, davon wurden 1211 Morulae für weitere Versuche verwendet. Die durchschnittlichen Entwicklungsraten an Tag 8 der Standard-Laborkontrolle lagen bei 23,7 %.
2.Die Auswertung der Zellfärbung ergab ähnliche Gesamtzellzahlen bei den Embryonen der Kontrollgruppen Kontrolle Tag 7 Blastozyste (KT7 Bla; n = 26), KT7 bioptiert (b; n = 20) und KT7 nicht-bioptiert (nb; n = 20) von durchschnittlich 104,5 ± 23,8, 92,6 ± 19,9 und 110,7 ± 33,7 Blastomeren. Die Embryonen der Kontrollgruppen KT7 Bla, KT7 b und
KT7 nb erreichten eine Lebend-Tot-Ratio von 31,6 ± 20,4, 14,6 ± 11,3 und 21,3 ± 14,1, dabei konnte ein signifikanter Unterschied zwischen den Embryonen der Kontrollgruppen KT7 Bla und den Embryonen der Gruppe KT7 b festgestellt werden. Es lagen keine weiteren Signifikanzen zwischen den Embryonen der Kontrollgruppe vor.
3.Trotz der unterschiedlichen Kombinationen von Proteinquelle, Konzentration und Manipulation zeigten die Embryonen der verschiedenen Gruppen in den Reexpansionsraten nach der Flüssigkonservierung keine signifikanten Unterschiede auf und lagen zwischen 37,0 % und 80,0 %. Die Ergebnisse der Schlupfraten reichten von 0,0 % bis 56,3 %. Die niedrigsten Werte der Reexpansions- und Schlupfraten entstanden bei Embryonen, welche mit AFP Typ III konserviert wurden, wohingegen die höchsten Werte mit dem Proteinzusatz FBS erreicht werden konnten. Grundsätzlich erreichte die FK mit dem Proteinzusatz FBS statistisch signifikant höhere Schlupfraten im Vergleich zu den Schlupfraten der Embryonen nach der FK mit dem Proteinzusatz AFP Typ III und FBS mit 0,1 % BSA, unabhängig von Konzentration und Manipulation. Es konnten keine Signifikanzen zwischen den Proteinzusätzen FBS und BSA festgestellt werden.
4.Bei der Zellfärbung erbrachten die Embryonen der unterschiedlichen Gruppen nach der Flüssigkonservierung ähnliche Zellzahlen von 87,7 ± 18,3 bis 122,2 ± 27,7. Die mit AFP Typ III flüssigkonservierten Embryonen erreichten die geringsten Zellzahlen. Diese waren signifikant niedriger als die Zellzahlen der Embryonen, welche mit den Proteinzusätzen BSA, FBS oder FBS mit 0,1 % BSA gelagert wurden. Es gab keine signifikanten Unterschiede zwischen den Zellzahlen bioptierter und nicht-bioptierter flüssigkonservierter Embryonen innerhalb eines Proteinzusatzes, unabhängig der Konzentration.
5.Die flüssigkonservierten Embryonen erreichten eine Lebend-Tot-Ratio zwischen 6,5 und 14,8. Je nach Gruppe entsprach das durchschnittlich 8-17 toten Zellen bzw.
8-16 % tote Zellen. Die Analyse der Lebend-Tot-Ratio ergab wiederholt signifikante Unterschiede in Bezug auf den Proteinzusatz. Die Embryonen, welche mit der Proteinquelle BSA konserviert wurden, erzielten eine signifikant niedrigere Ratio im Vergleich zu den Embryonen, welche mit FBS, FBS mit 0,1 % BSA oder AFP Typ III konserviert wurden. Weder die Konzentration noch die Manipulation hatten einen signifikanten Einfluss auf die Überlebensfähigkeit der Zellen. Mit einer durchschnittlichen Lebend-Tot-Ratio von 14,8, unabhängig der Manipulation, erreichten die mit 25 % FBS flüssigkonservierten, in vitro produzierten Embryonen die vielversprechendsten Ergebnisse.
6.Aus fünf Spendertieren (Färsen, Fleckvieh, ca. 14-18 Monate alt) konnten insgesamt 55 transfertaugliche Morulae gewonnen werden. Die Embryonen der Kontrollgruppen Gruppe 1 bioptiert (n = 5) und Gruppe 1 nicht-bioptiert (n = 5) erreichten Schlupfraten nach 72 h Kultivierung von 87,5 ± 17,7 % und 100 %. In der anschließenden Lebend-Tot-Färbung erreichten die Embryonen aus Gruppe 1 bioptiert eine durchschnittliche Gesamtzellzahl von 121,8 ± 29,5 und eine Lebend-Tot-Ratio von 13,8 ± 6,5. Diese Werte unterschieden sich nicht von den Ergebnissen der Embryonen aus Gruppe 1 nicht-bioptiert mit Zellzahlen von 122,4 ± 29,0 und einer Ratio von 17,1 ± 7,7. Insgesamt konnten keine signifikanten Unterschiede zwischen den in vivo generierten Embryonen der Kontrolle festgestellt werden.
7.Aufgrund der voran gegangen Untersuchungen mit in vitro produzierten Embryonen erfolgte die FK in vivo gewonnener Embryonen in TCM199 und 25 % FBS als Proteinzusatz. Bei keinem der in vivo produzierten Embryonen aus Gruppe 2 bioptiert (n = 13) kam es nach der FK und weiteren 72 h Kultivierung zum Schlupf (Schlupfrate 0,0 %). Die Schlupfraten der Embryonen aus Gruppe 2 nicht-bioptiert (n = 12) lagen bei 6,7 ± 11,6 %.
8.Die Lebend-Tot-Färbung unmittelbar im Anschluss an die FK der Embryonen Gruppe 3 bioptiert (n = 10) und Gruppe 3 nicht-bioptiert (n = 10) erbrachte durchschnittliche Zellzahlen von 77,2 ± 27,2 und 73,3 ± 15,5. Die Embryonen aus Gruppe 2 bioptiert und nicht-bioptiert, welche nach der FK und anschließender Kultivierung gefärbt wurden, erreichten Zellzahlen von 81,5 ± 31,6 und 84,1 ± 20,0. Zwischen den Zellzahlen der in vivo produzierten Embryonen der Gruppen 2 und Gruppen 3 konnten keine signifikanten Unterschiede ermittelt werden.
9.Die in vivo produzierten Embryonen erreichten eine Lebend-Tot-Ratio für Gruppe 2 bioptiert von 0,2 ± 0,3 und für Gruppe 2 nicht-bioptiert von 0,7 ± 0,7. Die Embryonen der Gruppe 3 bioptiert und nicht-bioptiert hingegen erreichten eine Lebend-Tot-Ratio von 8,5 ± 3,8 und 11,3 ± 4,5. Die niedrigen Ratios der Embryonen der Gruppen 2 entsprechen einer Anzahl von 55,8-67,8 toten Zellen. Die Lebend-Tot-Ratios der Embryonen aus den Gruppen 2 waren signifikant niedriger im Vergleich zu den Ratios der Embryonen aus den Gruppen 3.
Diese Ergebnisse zeigen, dass die Flüssigkonservierung in vitro produzierter bioptierter und nicht-bioptierter Embryonen in TCM199 mit 25 % FBS bei 0-4 °C für 168 h eine Alternative zur Kryokonservierung darstellen kann. Dies gilt nicht für in vivo gewonnene bovine Morulae. Es zeigte sich, dass unabhängig der Herkunft, die Biopsie keinen signifikanten Einfluss auf die flüssigkonservierten Embryonen hat. Grundsätzlich lassen die Ergebnisse darauf schließen, dass besonders die Proteinquelle einen entscheidenden Einfluss auf die Überlebensfähigkeit der Embryonen hat, dabei spielt die Konzentration nur eine sekundäre Rolle.
Die niedrigen bis nicht vorhandenen Schlupfraten, sowie die niedrige Lebend-Tot-Ratio der in vivo gewonnenen flüssigkonservierten Embryonen zeigen, dass sich das Entwicklungsstadium der Morula nicht für die FK eignet. Daher wäre es sinnvoll, die FK mit in vivo generierten Blastozysten zu wiederholen. Des Weiteren empfiehlt es sich sowohl bei in vitro als auch bei in vivo produzierten bovinen Embryonen den Einfluss der FK auf molekulargenetischer Ebene zu untersuchen. Um die Flüssigkonservierung abschließend als Alternative zur Kryokonservierung für eine kurze Lagerungsdauer zu etablieren, sollten Transfers zuvor flüssigkonservierter Embryonen auf Empfängertiere zur Ermittlung von Trächtigkeitsraten durchgeführt und die so entstandenen Kälber auf ihre Gesundheit untersucht werden.