Vergleich des Einflusses verschiedener Aktivierungsmethoden und Kultivierungsmedien auf die Vorkernausbildung nach intrazytoplasmatischer Injektion equiner Spermien in bovine Oozyten

Die ICSI stellt inzwischen im Bereich der IVP beim Pferd eine fest etablierte und viel genutzte Methode der Befruchtung dar, nicht zuletzt, weil die konventionelle IVF hier nach wie vor versagt. Zunächst wurde die IVM beim Pferd mit Maturationsraten von 48,2% etabliert. Erste Versuche zur ICSI beim Pferd wurden durchgeführt, jedoch mit bislang sehr geringen Teilungsraten (4,2%). Die heterologe ICSI bietet die Möglichkeit, eine bovine Oozyte als Modell zu nutzen und ein equines Spermium in diese zu injizieren, um so im Rahmen der Entwicklung der Zygote eine Aussage über die untersuchten Faktoren und gewonnenen Erkenntnisse auch aufs Pferd übertragen zu können. Ein Ziel dieser Arbeit war es, ein besseres Verständnis für die Abläufe innerhalb der Vorkernausbildung der Zygote zu gewinnen. Dazu wurden die Eizellen 18 Stunden nach der Injektion mit Hoechst 33342 gefärbt und beurteilt. Die der ICSI vorangegangene Behandlung der Spermien mit MitoTracker Green® FM ermöglichte dabei die Zuordnung einer der vorhandenen Vorkerne zum Spermienmittelstück und somit zur paternalen Seite. Das Vorhandensein von zwei ausgeschleusten Polkörpern bestätigte die erfolgreiche haploide Aktivierung der Eizelle im Rahmen der ICSI. Diese Methode ermöglichte eine genaue Aussage über die Erfolgsrate der ICSI. Im Rahmen dieser Versuche wurde zunächst der Einfluss der Glukosekonzentration im Kultivierungsmedium auf die Erfolgsrate der ICSI untersucht. Dazu wurden als Medien DMEM/F-12, SOFaa und SOFaa mit 16 mM Glukose eingesetzt und die Vorkernausbildung nach ICSI miteinander verglichen. Die ICSI und die Aktivierung der Eizelle erfolgte bei allen Gruppen mithilfe des Piezo-Elements. Die Ergebnisse zeigten, dass die Erfolgsraten der ICSI bei allen drei Gruppen keine signifikanten Unterschiede aufwiesen. Um den Glukosestoffwechsel während der Vorkernausbildung genauer zu untersuchen wurde die Glukosekonzentration im Medium vor und nach der ICSI beziehungsweise der Sham- Injektion durchgeführt. Hier konnte gezeigt werden, dass die Aktivierung der Eizellen keinen Einfluss auf die Glukosekonzentration hat und, dass sich die Konzentrationen vor und nach der ICSI/Sham-Injektion in keiner der untersuchten Gruppen voneinander unterscheiden. Der Glukosestoffwechsel scheint also bei der Vorkernausbildung keine große Rolle zu spielen. Als weiterer Einflussfaktor auf die Erfolgsrate der ICSI wurden verschiedene Aktivierungsprotokolle miteinander verglichen: Die Aktivierung mithilfe des Piezo-Elements, die chemische Aktivierung und eine Kombination aus beiden Methoden. Auch hier zeigten die Ergebnisse, dass die Wahl des Aktivierungsstimulus bei den gewählten drei Protokollen keinen signifikanten Einfluss auf die Erfolgsrate der ICSI hat. Bei den sham-injizierten Kontrollgruppen fiel jedoch auf, dass hier lediglich die chemisch aktivierte Gruppe hohe Raten einer erfolgreichen „haploiden“ Aktivierung zeigte. Bei der Gruppe, welche dahingegen mit der Kombination aus Piezo und chemischen Stimuli aktiviert wurde, waren die Raten der „diploiden“ Aktivierung signifikant höher. Dies kann ein Hinweis darauf sein, dass der Piezo die Verhinderung des Ausschleusens des zweiten Polkörpers zur Folge hat, wobei der Verdacht aufkam, dass ein negativer Einfluss auf das mikrotubuläre Netzwerk als Folge der minimalen Vibrationen ausgeübt wurde. Hierzu sind jedoch weitere Untersuchungen speziell zum Einfluss des Piezos und seiner Auswirkungen auf die Struktur innerhalb der Eizelle, insbesondere auf das mikrotubuläre Netzwerk, im Rahmen der ICSI von Interesse. Um die weitere Entwicklung der Zygoten nach der ICSI beurteilen zu können, wurden die Teilungsraten der ICSI nach chemischer Aktivierung, nach Aktivierung mit der Kombination aus dem Piezo und chemischen Stimuli, nach Sham-Injektion und chemischer Aktivierung sowie lediglich chemisch aktivierter Eizellen bestimmt. Hier zeigte die Gruppe Piezo + CA deutlich höhere Teilungsraten (21,5%). Es bleibt jedoch zu vermerken, dass auch die Teilungsraten der Kontrollgruppen (1. Sham-injiziert und chemisch aktiviert 2. Chemische aktiviert) sehr gering waren und daher vermutet wird, dass das genutzte Medium SOFaa + 16 mM Glukose einen negativen Einfluss auf die Entwicklung der behandelten Eizellen hatte. Zusammenfassend bleibt zu sagen, dass die durchgeführten Versuche einen neuen Einblick in das Modell der heterologen ICSI geben. So muss beispielsweise der Einsatz des Piezo-Elements hinsichtlich seines Einflusses auf das Ausschleusen des zweiten Polkörpers weiter untersucht werden. Zudem können gewonnene Erkenntnisse bezüglich der Auswirkung der Glukosekonzentrastion im Kultivierungsmedium und der verschiedenen Aktivierungsmethoden auf die paternalen Vorkernausbildung auch aufs Pferd übertragen und dort angewandt werden.