Replikation, Immunstimulation und Wirtsadaptation verschiedener Chlamydienspezies in humanen und bovinen monozyten-gereiften Makrophagen

Replication, stimulation of immune response and host-adaptation of different chlamydial species in human and bovine monocyte-derived macrophages

Chlamydiae are cocci-like, immobile, obligate intracellular bacteria. They are distinguished by a characteristic three stage replication cycle. Their metabolism is restricted, so they depend on distinct pathways of their host. Chlamydiae belong to the group of gram-negative bacteria. The chlamydial species C. pneumoniae, C. psittaci and C. muridarum, used in this study, belong to the genus Chlamydia and are part of the family Chlamydiaceae. All three species cause pneumonia in their particular hosts. The C. pneumoniae strain DC40 (TW-183) prefers humans as main hosts while the C. psittaci strain DC15 (A-6BC) is a ubiquitous species because it affects Psittacidae and Columbidae as well as mammals. The C. muridarum strain DC39 (Nigg) is solely collected from members of the family Muridae, which indicates a very tight host range. Chlamydiae affect epithelial cells preferentially, where they form the predominant clinical picture. They are also able to infect mononuclear cells, to which the macrophages belong. Macrophages are generated in the bone marrow from monocytes via the myeloid pathway. These monocytes then differentiate to macrophages in the tissue. They play a central role in the host immune system where they represent an important connector between the humoral and cell mediated immunity. Similar to the TH1/TH2 system, macrophages can be divided into M1 and M2 subtypes. The differentiation between the two is achieved by observing surface structure as well as cytokine and chemokine release. M1 macrophages mark the inflammatory defense pathway, while M2 macrophages show typical characteristics of an anti-inflammatory pathway. Macrophages play an important role in controlling pathogens: they represent the immune system’s first line of defense. While many studies working with monocytes/macrophages exist (Beagley, Huston et al., 2009), many questions remain unanswered. Most of these studies were restricted to one species and one distinct host. Studies which compare three different species in two different hosts are rare. In the present study, the adaptation of the pathogen to cellular and immunologic processes of the host (host adaptation) will be observed. Replication of Chlamydiae, their cytokine expression profile, the viability of the macrophages and their reaction to infection are of special interest. The first step of the experiments was to isolate and cultivate human and bovine monocyte-derived macrophages from whole blood samples of healthy donors. The cultivated cells were inoculated with C. pneumoniae, C. psittaci or C. muridarum, respectively. Samples for different analytical methods were collected. The results of these studies were separated into the following topics: growth and survival of the Chlamydiae, host response, and transcriptional characteristics of the chlamydiae. C. pneumoniae was not able to complete its replication cycle within 48 hours, as no elementary bodies were released into the supernatant. The replication cycle in human macrophages appeared delayed rather than turned off, as C. pneumoniae was neither destroyed nor inactivated. The increase of the mRNA expression of rpoN and IncA showed that it remained metabolically active. These two virulence factors are important for the differentiation of elementary into reticulate bodies. There was also evidence of chlamydial inclusions after 23 days in human macrophages (light microscopy). C. pneumoniae only marginally activated the macrophages and was not able to initialize an appropriate polarization to M1 or M2. The bovine macrophages were infected ineffectively as well. However, PCR-data revealed more chlamydiae in bovine macrophages than in human macrophages. There was also a slight increase of the ifu/cell (not significant) in bovine macrophages within 48 hours. Light and fluorescence microscopy revealed possible inclusions 24 hpi, which indicates a slightly faster reproduction cycle of C. pneumoniae in bovine macrophages compared to human macrophages. Bovine macrophages were more sensitive to an infection with Chlamydiae in general. C. pneumoniae was isolated several times from different organs (brain, joints, heart, vessels) of human hosts, human monocytes/macrophages could be regarded as transporter cells for C. pneumoniae. A delayed replication and continuous metabolic activity in human macrophages support this thesis, and promote the transportation and rapid resumption of the replication cycle in the target tissues, where epithelial cells will be infected first (vide Abbildung 40 and Abbildung 41). C. psittaci clearly proliferated in the two examined hosts. The expression of the virulence factors ftsW, rpoN and IncA were increased. Together with the significant increase of ifu/cell within 48 hours and of ifu/2ml 48 hpi, the distinct replication of C. psittaci could be revealed. The replication in bovine macrophages was significantly higher compared to human macrophages (about 10 fold). Simultaneously, bovine macrophages were destroyed earlier than human macrophages. Reticular bodies were also found outside the chlamydial inclusion in both hosts (TEM). C. psittaci produced a more severe inflammatory reaction in bovine macrophages than observed in human macrophages. Together with the outer membrane protein profile, a definite distinction between M1 and M2 macrophages of the human macrophages could not be achieved. However, there was a slight movement to the M1-phenotype. C. psittaci seemed to be more adapted to the human host, because a more moderate inflammatory reaction was produced and the cells remained vital for a longer period of time. In bovine macrophages, the infection proceeded more severely (vide Abbildung 40 and Abbildung 41). C. muridarum was not able to establish an effective infection in both hosts, because no new elementary bodies were released. However, in both hosts a severe inflammatory reaction of the macrophages was triggered. This was observed by the release of NO2ˉ and the expression of major inflammatory cytokines. In human macrophages, a phenotype similar to M1-macrophages was developed. Also, the expression of CD14, CD40 and CD86 was increased, a sign for the activation of immune cells. The simultaneous increase of the expression of an anti-inflammatory marker is evidence for the attempt of the organism to restore homeostasis after a severe inflammatory reaction. Furthermore, C. muridarum seemed to establish a partial persistent state in human macrophages. Indicators for this persistent state were the lack of release of elementary bodies, aberrant reticular bodies (TEM) and an increase of the expression of IFNγ in the monocyte-derived macrophages. Another reaction of C. muridarum to the severe inflammatory reaction of the macrophages was an increased mRNA-expression of Mcl-1. Along with the long life span of the human macrophages of more than 86 days, these observations hint at the inhibition of apoptosis. C. muridarum is not adapted well to a human or bovine host. However, it seemed to be more adapted to the human host, because moderate replication was observed in some human donor cells, and the reaction of the pathogen to the immune response of the macrophages revealed some pathways to extend its viability (vide Abbildung 40 and Abbildung 41).

Future prospects
The results of this study provide insight into the replication of different chlamydial species in diverse hosts. The adaptation to intracellular life and the host is different from species to species. The assumption that C. pneumoniae is adapted well to the distribution in the human organism must be examined with further studies. For this purpose, the observation time span must be extended for further quantitative analyses. The corresponding immunological processes should also be observed for at least two weeks. In addition, hints of inhibition of apoptosis were found in trials with C. pneumoniae and C. muridarum. Research with staurosporine and TUNEL should support these observations. Another interesting aspect of this study was that C. psittaci was able to proliferate in human macrophages in spite of a high IDO expression. Studies on the topics of the synthesis of tryptophan and its pathways in chlamydiae should clarify this observation. The heat shock protein GroEL was expressed to a very low amount by C. psittaci. This was beneficial for the development of C. psittaci, because the immune response of the infected cell was triggered less. Deeper examinations into this topic may reveal a mechanism that enables chlamydiae to hide from the immune response without establishing a persistent state. Furthermore, “free” reticulate bodies of C. psittaci were found in the cytoplasm of both hosts. Fiegl et al postulated a correlation with the MHCI-presentation pathway in dendritc cells (Fiegl, Kagebein et al. 2013). Continuative studies will clarify if the mechanism in this doctoral thesis were of similar origin. In the trial with C. muridarum, hints of an incipient persistent state similar to that of a natural infection were found. Most studies that deal with the persistent state of chlamydiae work with high stimulatory initiation dosages. The infection model of the present study can be used for observations of the development and establishment of the persistent state of chlamydiae under the terms of infection. C. muridarum is known to have a very tight host range. The extension of the present study to a host of the family of Muridae could be of great interest and would complete the entire infection model. The contested functions of the virulence factor CPAF can also be tested and explored with the present model. The present doctoral thesis offers a detailed insight into the adaptability of Chlamydiae. Differences between species and hosts were described and explained. A stable infection model, available for further studies, was established. As illustrated by the comments herein, the results of this study led to further questions and revealed topics for in depth research projects. Hence, the present study serves as a basis for the field of research: Host adaptation of Chlamydia. Replikation, Immunstimulation und Wirtsadaptation verschiedener Chlamydienspezies in humanen und bovinen monozyten-gereiften Makrophagen

Chlamydien sind kokkenähnliche, unbewegliche, obligat intrazelluläre Bakterien mit einem einzigartigen 3-phasigen Entwicklungszyklus. Sie sind metabolisch eingeschränkt, weswegen sie auf bestimmte Reaktionswege der Wirtszelle angewiesen sind. Sie werden zu den Gram(-)-Bakterien gezählt. Die in dieser Studie verwendeten Spezies C. pneumoniae, C. psittaci und C. muridarum gehören dem Genus Chlamydia an und werden zur Familie der Chlamydiaceae gezählt. Alle drei Spezies bilden im Wirt das Krankheitsbild einer Pneumonie aus. C. pneumoniae Stamm DC40 (TW-183) bevorzugt dabei den Menschen als Wirt. C. psittaci Stamm DC15 (A-6BC) befällt vorrangig Papageienvögel und Tauben, wurde aber auch aus Säugetieren isoliert und kann demnach als ein ubiquitärer Erreger eingestuft werden. C. muridarum Stamm DC39 (Nigg) wurde bisher nur aus Vertretern der Familie Muridae isoliert, zeigt also ein sehr enges Wirtsspektrum. Chlamydien befallen vorrangig epitheliale Zellen und bilden dort das vorherrschende Krankheitsbild heraus. Ebenso ist bekannt, das Chlamydien mononukleäre Zellen infizieren können. Zu diesem Zelltyp gehören die Makrophagen. Sie bilden sich aus der myeloiden Linie über Monozyten im Knochenmark heran und differenzieren sich im Gewebe zu Makrophagen. Sie nehmen eine zentrale Stellung während der wirtseigenen Immunantwort ein und sind ein wichtiges Verbindungsglied zwischen angeborener und erworbener Immunantwort. Makrophagen lassen sich ähnlich dem TH1/TH2-System in M1/M2-Makrophagen einteilen. Dazu wird das Antigen-Expressionsprofil und die Zytokin- und Chemokinabgabe der Makrophagen herangezogen. M1-Makrophagen stehen für den inflammatorischen Abwehrweg und M2-Makrophagen zeigen typische Eigenschaften eines anti-inflammatorischen Abwehrweges. Makrophagen stellen die erste Abwehrlinie des Immunsystems dar und spielen dadurch eine bedeutende Rolle bei der Bekämpfung von Krankheitserregern. Daher wurden viele Studien mit Chlamydien und Monozyten/Makrophagen durchgeführt (Beagley, Huston et al. 2009). Dennoch bleiben weiterhin viele Fragen offen. Die meisten Untersuchungen beschränkten sich auf die Nutzung einer Chlamydienspezies in einem speziellen Wirt. Studien, die den Vergleich zwischen drei verschiedenen Chlamydienspezies in verschiedenen Wirten anstellen sind rar. In der vorliegenden Studie soll die Anpassung des Pathogens an zelluläre und immunologische Prozesse des Wirts (Wirtsadaptation) untersucht werden. Dabei wird besonderes Augenmerk auf die Replikation der Chlamydien, auf ihr Zytokinexpressionsprofil, auf das Überleben der Makrophagen und ihre Reaktion auf eine Infektion gelegt. Für die Versuche wurden humane bzw. bovine monozyten-gereifte Makrophagen aus Vollblut isoliert und kultiviert. Die isolierten Zellen wurden mit C. pneumoniae, C. psittaci bzw. C. muridarum inokuliert, um Proben für verschiedenste Untersuchungsverfahren zu gewinnen. Die Ergebnisse dieser Untersuchungen wurden in die Themenbereiche Wachstum und Überleben der Chlamydien, Wirtszellantwort und Transkriptionsverhalten der Chlamydien eingeteilt. C. pneumoniae konnte in bovinen und humanen Makrophagen seinen Entwicklungszyklus innerhalb von 48 Stunden nicht abschließen, denn es wurden keine neuen Elementarkörperchen freigesetzt. In humanen Makrophagen schien der Entwicklungszyklus verzögert, anstatt komplett ausgesetzt zu sein, denn C. pneumoniae wurde weder zerstört noch inaktiviert. Vielmehr behielt es seine metabolische Aktivität bei, was man an einer Erhöhung der mRNA-Expression von rpoN und IncA ablesen konnte. Diese zwei Virulenzfaktoren spielen eine wichtige Rolle bei der Umwandlung von Elementarkörperchen in Retikularkörperchen. Es gab auch Anzeichen für chlamydiale Einschlüsse in humanen MDM nach ca. 23 Tagen (Lichtmikroskop). C. pneumoniae konnte die Makrophagen nur sehr geringfügig aktivieren und konnte keine eindeutige Polarisation in Richtung M1/M2 hervorrufen. Auch die bovinen Makrophagen konnten nicht effektiv infiziert werden. Die PCR-Daten zeigten aber signifikant mehr Chlamydien in den bovinen Makrophagen, als in den humanen. Es war auch eine leichte Zunahme der ifu/cell (nicht signifikant) zu erkennen. Im Licht- und Fluoreszenzmikroskop wurden mögliche Einschlüsse 24 hpi entdeckt, was darauf hinweist, dass der Entwicklungszyklus in bovinen Zellen etwas schneller als in humanen Zellen ablief. Rindermakrophagen waren generell empfindlicher gegenüber einer Infektion mit Chlamydien. C. pneumoniae konnte mehrfach aus anderen Organen (Gehirn, Gelenke, Herz, Blutgefäße) humaner Wirte isoliert werden, sodass Monozyten/Makrophagen als Trägerzellen diskutiert werden können. Dazu tragen die verzögerte Vermehrung und stete metabolische Aktivität in den humanen Makrophagen bei, welche einen Transport und eine rasche Wiederaufnahme des Reproduktionszyklus in den Zielgeweben begünstigen, wo sie epitheliale Zellen infizieren können (siehe Abbildung 40 und Abbildung 41). C. psittaci replizierte sich in beiden hier untersuchten Wirten sehr deutlich. Die Virulenzgene ftsw, rpoN und IncA wurden in beiden Wirten vermehrt exprimiert, was neben der signifikanten Erhöhung der ifu/cell und der ifu/2ml 48 hpi eine deutliche Replikation anzeigt. Die Replikation in den bovinen MDM war dabei signifikant höher als in humanen MDM (ca. 10 fach mehr ifu/cell). Gleichzeitig wurden die bovinen MDM deutlich früher zerstört, als die humanen MDM. In beiden Wirten wurden auch außerhalb der chlamydialen Einschlüsse Retikularkörperchen gefunden. In bovinen MDM wurde durch C. psittaci eine deutlich höhere inflammatorische Reaktion als in humanen MDM erzeugt. Zusammen mit dem Antigen-Expressionsprofil ließen sich die humanen MDM nicht eindeutig in M1/M2-Makrophagen einteilen, verschoben sich aber etwas mehr in Richtung M1-Makrophagenphänotyp. C. psittaci scheint etwas besser an den humanen Wirt angepasst zu sein, da dort eine moderatere inflammatorische Reaktion stattfand und die Zellen länger vital blieben. Die Infektion im bovinen Wirt verlief deutlich stürmischer (siehe Abbildung 40 und Abbildung 41). C. muridarum konnte in beiden Wirten keine effektive Vermehrung etablieren, denn es wurden keine neuen Elementarkörperchen freigesetzt. In beiden Wirten wurde aber eine deutliche inflammatorische Reaktion der MDM ausgelöst, was durch die Abgabe von NO2ˉ und die Erhöhung der Expression wichtiger inflammatorischer Zytokine zu erkennen war. In humanen MDM entwickelte sich ein Phänotyp, der M1-Makrophagen nahe kommt. Auch wurden CD14, CD40 und CD86 vermehrt exprimiert, was eine Aktivierung der Immunzellen anzeigt. Ein anti-inflammatorischer Marker wurde ebenfalls erhöht, was ein Anzeichen für die Wiederherstellung einer Balance nach einer starken entzündlichen Reaktion sein kann. Des Weiteren schien C. muridarum in humanen MDM ein unvollständiges persistentes Stadium zu etablieren, was durch die fehlende Freisetzung von EK, das Auftreten aberranter Retikularkörperchen (TEM) und einer erhöhten IFNγ-Expression durch die MDM gekennzeichnet war. Eine weitere Reaktion von C. muridarum auf die stark inflammatorische Reaktion der Makrophagen war die erhöhte mRNAExpression von Mcl-1, was zusammen mit der langen Lebensdauer der humanen MDM von mehr als 86 Tagen auf eine Apoptosehemmung hinwies. An die Wirte Mensch und Rind ist C. muridarum nicht gut angepasst. An den Menschen scheint er etwas besser angepasst zu sein. Denn in einigen Spendermakrophagen war eine moderate Vermehrung zu erkennen und die Reaktionen des Bakteriums auf die Abwehrmechanismen der MDM zeigten Wege auf, um in humanen MDM länger zu überleben (siehe Abbildung 40 und Abbildung 41).

Ausblick
Die Ergebnisse dieser Studie zeigen einen Einblick in die Vermehrung verschiedener Chlamydienspezies in unterschiedlichen Wirten. Die Anpassung an das intrazelluläre Leben und an den Wirt ist von Spezies zu Spezies verschieden. Die Annahme, dass C. pneumoniae gut an die Verbreitung im menschlichen Organismus angepasst ist, muss durch weiterführende Studien untersucht werden. Dazu gehört eine Verlängerung des Beobachtungszeitraums für die quantitative Untersuchung. Auch die zugehörigen immunologischen Prozesse müssten über mindestens 2 Wochen beobachtet werden. Des Weiteren fanden sich im Versuch mit C. pneumoniae Hinweise auf eine Apoptosehemmung, die durch Untersuchungen mit Staurosporin oder TUNEL weiter verdichtet werden können. Ein weiteres interessantes Ergebnis war, dass sich C. psittaci, trotz hoher IDO-Expression gut vermehren konnte. Studien, die sich mit dem Tryptophansyntheseweg der Chlamydien beschäftigen, könnten hier ansetzen. Das Hitzeschockprotein groEL wurde von C. psittaci nur in geringem Maße exprimiert, was für die Entwicklung von C. psittaci von Vorteil ist, da die Immunantwort der infizierten Zelle weniger stimuliert wird. Vertiefende Untersuchungen hierzu könnten einen Mechanismus aufdecken, der es Chlamydien ermöglicht vom Immunsystem weitestgehend unentdeckt zu bleiben, ohne in Persistenz zu gehen. Des Weiteren fanden siche „freie“ Retikularkörperchen von C. psittaci im Zytoplasma beider Wirte. Fiegl et al postulierten einen Zusammenhang mit dem MHCI-Präsentationsweg in einer dendritischen Zellinie (Fiegl, Kagebein et al. 2013). Weitere Versuche hierzu können Klarheit darüber verschaffen, ob hier ein ähnlicher Mechanismus vorlag. Im Versuch mit C. muridarum sind Hinweise für eine beginnende Persistenz aufgetreten, die einer natürlichen Infektion nahe kommen. Persistenzstudien werden oft mit einer hohen Persistenzauslösenden Stimulation durchgeführt. Das hier vorgestellte Modell könnte die Entstehung und Etablierung einer Persistenz unter Infektionsbedingungen untersuchen. Da C. muridarum ein sehr enges Wirtsspektrum hat, wäre die Erweiterung des hier eingesetzten Versuchsmodells auf die Familie der Muridae sehr interessant und würde die Versuchsreihe komplettieren. Auch die angezweifelten Funktionen des Virulenzfaktors CPAF könnten in dem hier vorgestellten Versuchsmodell überprüft und weiter erforscht werden.
Die hier vorgestellte Arbeit ermöglicht einen guten Einblick in das Anpassungsvermögen der Chlamydien. Es konnten Unterschiede verschiedener Spezies in verschiedenen Wirten dargestellt und erklärt werden. Es wurde ein stabiles Modell etabliert, das für viele weiterführende Studien zur Verfügung steht. Wie erläutert ergaben sich aus den Ergebnissen dieser Studie einige weitere Fragen und Ansatzstellen für tiefergehende Forschungsprojekte. Somit dient die vorgelegte Arbeit als Grundlage für das Forschungsgebiet der Wirtsadaptation von Chlamydien.