Der neuroprotektive und neuroregenerative Effekt von CRMP-5 im experimentellen Glaukom auf retinale Ganglienzellen in vitro

Zielsetzung: Collapsin-response-mediator-protein 5 (CRMP-5) wird eine wichtige Rolle in der Ausbildung eines neuronalen Netzwerkes im ZNS und der Führung der Wachstumskegel von Axonen zugesprochen. Ziel dieser Studie war es die Rolle von CRMP-5 in einem Glaukomtiermodell zu analysieren. Außerdem sollten dessen potentielle neuroprotektive und –regenerative Effekte auf retinale Ganglienzellen (RGZs) und deren Axone an retinalen Explantaten, die in vitro aus adulten Sprague Dawley Ratten kultiviert wurden, getestet werden.

Methodik: Durch unilaterale Episkleralvenenverödung bei adulten weiblichen Sprague Dawley Ratten (n=14) wurde der IOD über sieben Wochen erhöht. Proteomische Veränderungen von CRMP-5 innerhalb der Retinae wurden massenspektrometrisch untersucht. Zur Untersuchung neuroprotektiver Effekte wurden retinale Explantate adulter Sprague Dawley Ratten in vitro für zwei Tage in einer Druckkammer (60 mmHg) mit und ohne die Applikation verschiedener Konzentrationen von CRMP-5 inkubiert (n=12). Zusätzlich wurde ein Antikörper gegen aktivierte Proteinkinase B (PKB) hinzugefügt, um eine mögliche Interaktion mit CRMP-5 nachzuweisen. Für die Quantifizierung vitaler RGZs wurden retinale Flatmounts immunhistologisch gegen Ganglienzell-spezifisches BRN3A angefärbt. Zur Untersuchung neuroregenerativer Effekte von CRMP-5 wurde drei Tage vor der Explantation der Retinae eine unilaterale Sehnervenquetschung in Kombination mit einer Linsenverletzung durchgeführt. Die retinalen Explantate wurden anschließend unter regenerativen Verhältnissen mit (n=5) und ohne (n=5) die Zugabe von CRMP-5 für sieben Tage inkubiert. Die Anzahl und Länge der ausgewachsenen Neurite wurden zu unterschiedlichen Zeitpunkten bestimmt, Mittelwerte gebildet und verglichen. Um mögliche intrazelluläre Signalwege und Interaktionen zu untersuchen wurden CRMP-5 und PKB mittels Immunhistologie und Mikroarray in den Proben der Protektions- und Regenerationsstudien detektiert.

Ergebnisse: Der IOD adulter Sprague Dawley Ratten konnte durch eine unilaterale Episkleralvenenverödung signifikant erhöht werden. In massenspektrometrischen Untersuchungen der Retinae wurde CRMP-5 dreifach herunterreguliert detektiert. Die Zugabe von CRMP-5 zu der retinalen Organkultur konnte dosisabhängig die Überlebensrate von RGZs, die unter Druck inkubiert wurden signifikant erhöhen. Weiterhin konnte CRMP-5 nach unilateraler Sehnervenquetschung in Kombination mit einer Linsentraumatisierung den Neuritenauswuchs aus retinalen Explantaten signifikant erhöhen und verlängern. Vor allem die Anzahl der über 400 µm langen Neurite nahm durch die Zugabe von CRMP-5 signifikant zu. Mittels Mikroarray und Immunhistologie konnte sowohl die intrazelluläre Aufnahme von CRMP-5 als auch eine vermehrte Aktivierung von PKB nachgewiesen werden.

Schlussfolgerung: CRMP-5 scheint eine wichtige Rolle in der Pathophysiologie eines Glaukomtiermodells zu spielen und weist sowohl neuroprotektive als auch neuroregenerative Effekte in vitro auf. Die Herunterregulierung ist vermutlich eine Reaktion auf die IOD-Erhöhung. Zusätzlich wird CRMP-5 fast ausschließlich im postnatalen ZNS exprimiert. Die Zugabe von CRMP-5 konnte das Überleben der RGZs signifikant verbessern. Weiterhin ermächtigte es die RGZs zu einer höheren Regenerationsrate und zu einem beschleunigten Neuritenauswuchs. Diese Effekte könnten möglicherweise durch eine Aktivierung von PKB vermittelt werden. PKB beeinflusst zahlreiche intrazelluläre Signalwege, wie die Inhibition von Apoptose oder die Expression von zellüberlebensfördernden Genen.