UNTERSUCHUNGEN ZUR CHROMATINKONDENSATION CANINER SPERMATOZOEN

Ziel dieser Arbeit war es unterschiedliche Färbungen zur Darstellung der Chromatinkondensation in caninen Spermatozoen zu testen und miteinander zu vergleichen. Wichtig war es für bereits etablierte Methoden umfassendere Ergebnisse zu erhalten und diese mit Verfahren zu vergleichen, die noch nicht für den Rüden etabliert sind. Weiterhin sollte die Praktikabilität der Färbemethoden getestet werden, wobei auch finanzielle und gesundheitliche Aspekte zu beachten sind. Es wurden Samenzellen von insgesamt 48 fertilen Rüden untersucht, wovon zwanzig Proben Nativsamenpräparate darstellten, zwanzig Proben kryokonservierte Spermien waren und weitere acht Proben aus dem Nebenhodenschwanz kastrierter Rüden entnommen und kryokonserviert wurden. Pro Samenprobe wurden zur Untersuchung der Chromatinkondensation sieben Färbungen und Auswertungen vorgenommen. Folgende Methoden wurden verwendet: Anilinblau, Toluidinblau, Chromomycin A3, Akridinorange (zwei verschiedene Protokolle), TUNEL und Caspase-3-Aktivität.
Zusätzlich wurden bei den zwanzig Nativsamenpräparaten eine makroskopische Samenuntersuchung, eine Eosinfärbung zur Vitalitäts- und Morphologiebeurteilung, sowie eine Motilitätsbestimmung vorgenommen. Dreizehn der nativen Präparate wurden zusätzlich mittels computerassistierter Samenanalyse beurteilt.
Es ergaben sich folgende Ergebnisse:
- Alle Rüden zeigten weniger als 9 % Spermien mit Chromatininstabilitäten, wobei die Mittelwerte aller Untersuchungen unter 2,53 % lag.
- Es bestand keine Wechselwirkung zwischen Probenart und dem Färberesultat, weshalb alle untersuchten Methoden zur Darstellung der Chromatinkondensation auch für kryokonservierte canine Samenproben geeignet sind.
- Mittels zweifaktorieller Varianzanalyse mit Messwiederholung bezüglich der Färbung fanden sich deutlich unterschiedliche Untersuchungsergebnisse.
- Der gezielte Vergleich der Akridinorange-Färbeprotokolle mittels T-Test ergab für die TG-Spermaproben keine signifikanten Unterschiede, weshalb der erhöhte Kosten- und Zeitaufwand des mfSCSA bei ähnlichen Auswertungsschwierigkeiten und Gesundheitsrisiken wie beim AOT, nicht gerechtfertigt scheint.
- Die Anilinblaufärbung ist die schnellste der untersuchten Methoden und erfordert als lichtmikroskopische Methode kein teures Equipment, wobei die Kontraste zwischen schlecht und gut kondensierten Spermien schwächer sind als im aufwendigeren Toluidinblau-Test.
- Signifikante Korrelationen ergaben sich für die Nativsamenproben zwischen dem AOT mit der Anilinblaufärbung (r = 0,567) und dem CMA3-Test (r= 0,645). Ein Korrelationskoeffizient von r =0,455 besteht zwischen Anilinblau mit Toluidinblau und von r = 0,557 zwischen Anilinblau und TUNEL, sowie mit r = 0,538 für CMA3 und Toluidinblau.
- Bei den TG-Proben korrelierten die Ergebnisse des AOT mit p < 0,01 mit Anilinblau (r = 0,582), mfSCSA (r = 0,682) und CMA3 (r = 0,752) und zusätzlich korrelierte die Toluidinblaufärbung mit der Anilinblaufärbung (r = 0,698). Eine Korrelation mit p < 0,05 ergab sich für den CMA3-Test mit Anilinblau (r = 0,536), Toluidinblau (r = 0,453) und den mfSCSA (r = 0,544).
- Die Ergebnisse der Färbungen der kryokonservierten Nebenhodenspermien korrelierten mit p < 0,05 zwischen dem CMA3 und Toluidinblau (r = 0,719) sowie zwischen dem AOT und TUNEL-Test (r = 0,760). Die geringe Probandenzahl von acht Rüden ist bei der Interpretation der Ergebnisse zu beachten.
- Es besteht nur ein geringer Zusammenhang zwischen den Ergebnissen der klassischen Samenuntersuchung und denen der Chromatinkondensation. Die Motilität korreliert negativ mit p < 0,05 mit dem Anteil chromatininstabiler Spermien im AOT (r = 0,450), während die Caspase-3-Aktivität negativ mit der Vitalität (r = 0,463) und positiv mit der Pathomorphologie (r = 0,445) korreliert.

Für die veterinärmedizinische Andrologie beim Rüden ist der Toluidinblautest als lichtmikroskopische Färbemethode und die Chromomycin A3-Färbung als einfaches, schnelles und kostengünstiges fluoreszenzmikroskopisches Verfahren zu empfehlen.