Untersuchungen zu Glykoprotein (GP) Ib-abhängigen stimulatorischen und inhibitorischen Funktionen und Signalwegen von Thrombozyten

In der vorliegenden Arbeit wurde das Schlangengift-Protein Echicetin als selektiver GPIbα-Ligand aus dem Gift der gemeinen Sandrasselotter Echis carinatus sochureci mittels Affinitätschromatografie erfolgreich isoliert und seine Reinheit mittels Western-Blot Analyse bestätigt. Die funktionelle Intaktheit des isolierten Echicetinproteins konnte durch seine inhibierende Wirkung auf die Ristocetin induzierte TZ-Aggregation und TZ-Agglutination mittels Licht-transmissionaggregomet¬rie gezeigt werden.
Wurden Polystyrol-Beads mit dem isolierten Echicetin in einer definierten Konzentration beschichtet, induzierten diese Echicetin-Beads eine GPIIb/IIIa abhängige Aggregation sowohl von gewaschenen humanen als auch murinen Thrombozyten, die durch Präinkubation mit dem Echicetinprotein oder mit dem GPIIb/IIIa-Blocker Aggrastat® vollständig gehemmt werden konnte. Damit konnten publizierte Daten von A. Navdaev et al. (2014) erfolgreich bestätigt und weiter ausgebaut werden. Ebenso konnte keine Aggregation von gewaschenen humanen GPIIb/IIIa-defizienten Thrombozyten durch Echicetin-Beads ausgelöst werden, wodurch belegt wurde, dass die Bindung von Echicetin-Beads an die Oberfläche von Thrombozyten eine Aktivierung des Integrins GPIIb/IIIa und damit eine signalabhängige TZ-Aggregation auslöst. Die durch Echicetin-Beads nicht auslösbare Aggregation von gewaschenen murinen Thrombozyten, denen ein intaktes GPIbα fehlt, zeigt, dass Echicetin-Beads selektiv und spezifisch Thrombozyten über GPIbα aktivieren.
In der vorliegenden Arbeit wurde desweiteren der Einfluß der direkten Thrombininhibitoren (DTIs) Refludan® und Dabigatran® auf die GPIbα-vermittelte TZ-Aktivierung untersucht. Sowohl Refludan® als auch Dabigatran® hemmten die Echicetin Beads induzierte aktivierungsabhängige Aggregation gewaschener humaner und muriner Thrombozyten sowie die Ristocetin-induzierte Aggregation in humanem TZ reichen Plasma (PRP). Sie beeinflussten jedoch nicht die vWF/Ristocetin induzierte aktivierungsunabhängige TZ-Agglutination in gewasche-nen humanen Thrombozyten. Diese Ergebnisse weisen darauf hin, dass die unter-suchten DTIs einen signalabhängigen Einfluss auf die GPIbα-vermittelte TZ Aggregation ausüben, aber nicht die vWF/GPIbα-Interaktion hemmen. Es wurden deshalb mögliche Mechanismen untersucht, die den hemmenden Effekt der DTIs Refludan® und Dabigatran® auf die GPIbα-vermittelte TZ-Aggregation erklären könnten.
Hierzu konnte gezeigt werden, dass weder Echicetin-Beads in gewaschenen huma-nen TZ noch Ristocetin in humanem PRP eine Thrombinbildung in vitro induzieren. Somit ist möglicherweise durch GPIbα-induziertes generiertes Thrombin, das als sehr potenter TZ-Agonist fungiert, als Target der DTIs eher unwahrscheinlich.
Zudem wurde der Einfluss der untersuchten DTIs auf eine mögliche „Feed-back“ Agonisten-mediierte TZ-Aktivierung untersucht, da die GPIbα-vermittelte TZ Aggregation sowohl durch Adenosindiphosphat (ADP) als auch durch Thrombo-xan-A2 (TXA2) verstärkt wird. Es konnte gezeigt werden, dass weder Refludan® noch Dabigatran® einen Einfluss auf die TZ-Aggregation, induziert durch die beiden „Feedback“-Agonisten ADP bzw. TXA2 im PRP bzw. in gewaschenen TZ, hatten. Daher ist sehr unwahrscheinlich, dass der hemmende Effekt der untersuchten DTIs auf die GPIbα-vermittelte TZ-Aggregation durch eine Hemmung der ADP- bzw. TXA2 mediierten Signalwege erklärbar ist.
Hingegen konnte gezeigt werden, dass Refludan® und Dabigatran® in gewaschenen humanen TZ sowohl einen Anstieg der intrazellulären cGMP-Konzentration als auch eine verstärkte Phosphorylierung von VASP an Serin239 induzieren. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass die untersuchten DTIs inhibierende thrombozytäre Signalwege stimulieren. Die Frage, auf welcher Ebene und in welchem Ausmaß sie die GPIbα-mediierten Signalwege beeinflussen, muss durch zukünftige Untersuchungen beantwortet werden.
In der vorliegenden Arbeit konnte bezüglich der GPIbα-vermittelten Signalwege ge-zeigt werden, dass Echicetin-Beads die Phosphorylierung der MAP-Kinase p38, der Serin/Threonin-Kinase Akt, der Tyrosinkinase Syk und von Tyrosinresten weiterer thrombozytärer Signalproteine mit den Molekulargewichten 145kDa, 125kDa, 95kDa, 72kDa und 64kDa induzieren. Die Phosphorylierung war jeweils abhängig von Kinasen der Src-Familie (SFKs), da sie durch Präinkubation mit dem SFK-Inhibitor PP2 inhibiert werden konnte. Der NO-Donor SNP bzw. das Prostazyklin-Analogon
Iloprost als jeweilige Induktoren der NO/sGC/cGMP/PKG bzw. der AC/cAMP/PKA vermittelten Signalwege hemmten die Echicetin-Beads-induzierte Phosphorylierung von p38 und Akt. Sie hatten überraschenderweise jedoch keine inhibierende und sogar teilweise eine stimulierende Wirkung auf die Echice-tin Beads induzierte Tyrosinphosphorylierung der verschiedenen Signalproteine einschließlich Syk. Die diesem wichtigen Effekt zugrundeliegenden Mechanismen müssen in zukünftigen Untersuchungen aufgeklärt werden.
Insgesamt konnten die erzielten Ergebnisse erstmals ein breites Spektrum spezifi-scher GPIbα-aktivierter Signalwege und Effekte in humanen Thrombozyten aufzei-gen, die möglicherweise von großer physiologischer und pharmakologischer Bedeutung sind.