Charakterisierung des molekularen Wirkmechanismus des Varroazids Ameisensäure auf Honigbienen und Varroa-Milben

This work investigated the influence of the varroacide formic acid on the honeybee Apis mellifera as well as its parasite Varroa destructor. Varroosis, in combination with other factors, leads to partially massive honeybee colony losses. These are of enormous ecological and economic importance, making an efficient drug treatment of the bee colonies obligatory. Formic acid is currently considered the most reliable and relatively simple treatment method due to its numerous advantages over other active substances, although damage to the honeybee may occur during this treatment. In order to increase the understanding of the mechanism of action of formic acid and to reduce the negative effects on the honeybee in the future by an adapted application, the reaction to 60% formic acid in honeybees and varroa mites was investigated using comparative molecular biological and biochemical methods. In the present study, molecular endogenous effects of formic acid treatment on gene expression in honeybee and varroa mite were investigated. For this purpose, RNA-Seq was applied and the results were subsequently validated by RT-qPCR analyses. Subsequent proteome analyses were performed to detect the correlating proteins in order to determine whether these detected transcriptional changes are also reflected in the protein pattern. In this work corresponding experiments were carried out for the varroa mite, the least studied model. Since even the concentration of a protein in a system does not provide valid details about its activity and function, the formic acid-specific activity of selected enzymes was examined in functional assays in the last part of the work. For this purpose, an activity assay of Cytochrom C oxidase was established in a microtiter plate system. Further investigations of the enzymatic activity of some important candidate proteins will follow by their recombinant expression with subsequent functional assays.
The results of transcriptome analysis in honeybees indicate that the known higher formic acid sensitivity of the younger larval stages compared to the newly hatched worker bees is due to a lower detoxification capacity as a result of a reduced equipment with appropriate detoxification enzymes compared to adult bees. However, a detection of formic acid-induced candidate genes in honey bees could not be achieved in varroa mites. This could indicate different formic acid metabolism strategies between these two organisms. On this basis, the persistent problem of unwanted damage to bees during formic acid treatment could be solved by developing new formulations and/or applications that target specific target structures in the mites.
The proteome analysis of formic acid-treated varroa mites indicated an imbalance in proteostasis due to restricted protein synthesis combined with increased protein degradation. This indicates a significant loss of mass and could explain a damaging effect of formic acid on the varroa mites. The formic acid-exposed varroa mites showed an induction of heat shock proteins, an indicator of oxidative stress. This is presumably caused by a specific inhibition of the respiratory chain and the citrate cycle, which is proven in our data. As a result, damage to cellular macromolecules leads to the ageing of the organism and ultimately to cell death. The proteome analysis further revealed an increased concentration of several candidate proteins associated with detoxification, which however did not correlate with the transcriptome analysis. Overall, the investigation of the proteins with the components of the respiratory chain provided the presumed primary target site of formic acid action as well as the defence mechanisms responsible for formic acid-generated toxicity, which according to our data mainly include heat shock proteins and detoxification enzymes.
The initial results of the activity studies of Cytochrom C oxidase indicate an inhibition by formic acid. These results confirm previous findings from the literature and further data sets of this work. Thus, formic acid damage appears to be a consequence of oxidative stress produced by inhibition of cellular respiration with lactic acidosis.
In summary, our data show for the first time molecular effects of formic acid treatment on honeybees and simultaneously on varroa mites. Based on the findings of this study, future treatment strategies can be specifically adapted to the varroa mite, thereby significantly increasing the success of treatment in varroa control; the negative effects on honeybees, which have frequently occurred up to now, can be reduced by a better understanding of the molecular processes. Diese Arbeit untersuchte den Einfluss des Varroazids Ameisensäure auf die Honigbiene Apis mellifera sowie ihren Parasiten Varroa destructor. Die Varroose führt, in Kombination mit weiteren Faktoren, zu teils massiven Honigbienen-Völkerverlusten. Diese sind von enormer ökologischer und ökonomischer Bedeutung, sodass eine effiziente medikamentöse Behandlung der Bienenvölker obligat ist. Die Ameisensäure gilt aufgrund zahlreicher Vorteile gegenüber anderen Wirkstoffen als derzeit zuverlässigste und relativ einfache Behandlungsmethode, obwohl es auch während dieser Behandlung zur Schädigung der Honigbiene kommen kann. Um das Verständnis zum Wirkmechanismus der Ameisensäure zu erweitern und zukünftig durch eine adaptierte Applikation die negativen Effekte bei der Honigbiene zu reduzieren, wurde die Reaktion auf 60%ige Ameisensäure in Honigbienen und Varroa-Milben mittels vergleichender molekularbiologischer und biochemischer Methoden untersucht. In der vorliegenden Arbeit sollten molekulare endogene Effekte einer Ameisensäure-Behandlung auf die Genexpression in Honigbiene und Varroa-Milbe untersucht werden. Hierfür wurde die Technik der RNA-Seq angewandt und nachfolgend die Ergebnisse mittels RT-qPCR-Analysen validiert. Anschließende Proteom-Analysen sollten die korrelierenden Proteine erfassen, um zu überprüfen, ob diese nachgewiesenen transkriptionellen Veränderungen auch im Protein-Muster entsprechend reflektiert sind. Entsprechende Versuche wurden für die Varroa-Milbe als bisher am wenigsten untersuchtes Modell in dieser Arbeit durchgeführt. Da selbst die Konzentration eines Proteins in einem System keine gültigen Details über seine Aktivität und Funktion liefert, wurden im letzten Teil der Arbeit die Ameisensäure-spezifische Aktivität ausgesuchter Enzyme in Funktions-Assays überprüft. Dazu wurde ein Aktivitäts-Assay der Cytochrom C Oxidase im Mikrotiterplatten-System etabliert. Weiterführende Untersuchungen der enzymatischen Aktivität einiger wichtiger Kandidatenproteine soll durch deren rekombinante Expression mit nachfolgenden Funktions-Assays folgen.
Die Ergebnisse der Transkriptom-Analyse bei Honigbienen deuten darauf hin, dass die bekanntlich höhere Ameisensäure-Empfindlichkeit der jüngeren Larvenstadien im Vergleich zu den frisch geschlüpften Arbeiterinnen auf eine niedrigere Entgiftungskapazität durch eine reduzierte Ausstattung mit entsprechenden Entgiftungsenzymen gegenüber adulten Bienen zurückzuführen ist. Ein Nachweis der durch Ameisensäure induzierten Kandidatengene in Honigbienen konnte allerdings in Varroa-Milben nicht geleistet werden. Dies könnte für unterschiedliche Ameisensäure-Metabolisierung-Strategien zwischen diesen beiden Organismen sprechen. Auf dieser Grundlage könnte das anhaltende Problem der unerwünschten Schädigung der Bienen während der Ameisensäure-Behandlung durch die Entwicklung neuer Formulierungen und/oder Anwendungen gelöst werden, die spezielle Zielstrukturen in den Milben treffen.
Die Proteom-Analyse der Ameisensäure-behandelten Varroa-Milben deutete eine Imbalance in der Proteostase infolge einer eingeschränkten Proteinsynthese bei gleichzeitig gesteigertem Proteinabbau an. Dies deutet auf einen deutlichen Masseverlust hin und könnte eine Schadwirkung der Ameisensäure auf die Varroa-Milben erklären. Die Ameisensäureexponierten Varroa-Milben zeigten eine Induktion von Hitzeschockproteinen, ein Anzeichen für oxidativen Stress. Dieser wird vermutlich ausgelöst durch eine, in unseren Daten belegte, spezifische Hemmung der Atmungskette und des Citrat-Zyklus. Dies führt durch Schädigung von zellulären Makromolekülen zur Alterung des Organismus und letztendlich zum Zelltod. Die Proteom-Analyse ergab weiterhin eine gesteigerte Konzentration mehrerer Kandidatenproteine, die mit der Detoxifikation assoziiert sind, die allerdings mit der Transkriptom-Analyse nicht korrelierten. Insgesamt lieferte die Untersuchung der Proteine mit den Bestandteilen der Atmungskette den mutmaßlich primären Zielort der Ameisensäure-Wirkung sowie die für die Ameisensäure-generierte Toxizität verantwortlichen Abwehrmechanismen, zu denen nach unserer Datenlage hauptsächlich die Hitzeschockproteine und Detoxifikationsenzyme zählen.
Die initialen Ergebnisse der Aktivitäts-Untersuchungen der Cytochrom-C-Oxidase deuten auf eine Hemmung durch Ameisensäure hin. Diese Ergebnisse bestätigen bisherige Erkenntnisse aus der Literatur und weitere Datensätze dieser Arbeit. Somit scheint die Ameisensäure-Schadwirkung eine Folge des oxidativen Stresses, erzeugt durch die Hemmung der zellulären Atmung mit laktischer Azidose zu sein.
Zusammenfassend zeigen unsere Daten erstmals molekulare endogene Effekte einer Ameisensäure-Behandlung auf Honigbienen und gleichzeitig auf Varroa-Milben. Auf Grundlage der Erkenntnisse dieser Studie können zukünftige, neue Strategien der Behandlung spezifisch an die Varroa-Milbe angepasst und dadurch der Behandlungs-Erfolg bei der Varroa-Bekämpfung deutlich erhöht werden; die bisher häufig auftretenden negativen Effekte auf Honigbienen können durch das bessere Verständnis der molekularen Prozesse reduziert werden.