Methodische Arbeiten zur Entwicklung verbesserter Enzymaktivitätsbestimmungen von Xylanasen und Glucanasen in komplexen Proben (Futtermitteln und Digesta)

Doktorarbeit / Dissertation aus dem Jahr 1999 im Fachbereich Chemie - Allgemeines, Note: 3,0, Freie Universität Berlin (Chemie), Sprache: Deutsch, Abstract: Inhaltsangabe:Problemstellung:
In der Tiernährung werden verschiedene Enzyme eingesetzt, um bei landwirtschaftlichen Nutztieren antinutritive Effekte pflanzlicher Futtermittel zu beseitigen und die Futterverwertung zu verbessern. Nichtstärkepolysaccaride abbauende Enzyme unterstützen die Verdauungskapazität körpereigener Enzyme, indem viskositätsbildende Futterkomponenten für die das Tier keine eigenen Enzyme besitzt, partitiell hydrolysiert werden, und durch körpereigene Enzyme verdauliche Nahrungsbestandteile auf Grund einer Solubilisierung von Zellwandkomponenten dem enzymatischen Abbau besser zugänglich gemacht werden. So senken Xylanasen und ß-Glucanasen die Viskosität des Nahrungsbreis im Verdauungstrakt und fördern dadurch die Verdaulichkeit der Hauptnährstoffe z.B., bei Broilern.
Kommerzielle Nichtstärkepolysaccharide spaltende Enzyme werden meist durch Fermentationsprozesse mit Pilzen hergestellt. Der Einschluss NSP-spaltender Enzyme in die EU-Futterzusatzstoffdirektive hat folgende Forderung an die Enzymanaltytik gestellt: da die Enzyme in den Beschreibungen der Futtermittel als Zusatzstoffe deklariert werden müssen, verlangen die zuständigen Behörden eine Testmethode zur Enzymaktivitätsbestimmung im Futtermittel, damit die beigemengten Enzyme tatsächlich den Konzentrationen entsprechen, die in Produktspezifikation angegeben sind.
Das geltende Futtermittelrecht fasst alle Wirkstoffe unter dem Begriff Futterzusatzstoffe zusammen. Juristisch gelten für Enzyme in Futtermitteln die gleichen Anforderungen, wie sie an andere Futterzusatzstoffe gestellt werden. Ihre Unbedenklichkeit für das Tier und den Menschen als Endverbraucher muß gesichert, die Wirksamkeit erwiesen und die Kontrollierbarkeit gewährleistet sein.
Um die Kontrollierbarkeit und die Wirksamkeit zu gewährleisten ist es notwendig, die Aktivitätsbestimmung von Enzymen in komplexen Proben mit einfachen, aber exakten Methoden weiter zu optimieren.
Inhaltsverzeichnis:Inhaltsverzeichnis:
1.Einleitung1
2.Problemstellung2
3.Grundlagen4
3.1NSP hydrolysierende Enzyme, die als Futterzusatzstoffe von Bedeutung sind4
3.2Substrate zur Enzymaktivitätsbestimmung5
3.2.1Xylane5
3.2.2b Glucane6
3.3Futtermittel7
3.4Literaturübersicht7
3.4.1Häufig angewendete Methoden in der Enzymanalytik7
3.4.2Verwendung modifizierter Substrate10
4.Materialien, Methoden und Versuchsdurchführung15
4.1Charakterisierung der Enzyme15
4.1.1Extraktionsmethode15
4.1.2Proteinbestimmung15
4.1.3Enzymaktivität über die Bildung von Reduktionsäquivalenten15
4.1.4Enzymreinigung16
4.1.5Bestimmung der Molmassen und Verteilung der aktiven Komponenten mit Hilfe der Gelelektrophorese17
4.1.6Bestimmung der pH Optima17
4.1.7Temperaturverhalten der Enzympräparate18
4.1.8Bestimmung der isoelektrischen Punkte18
4.1.9Bestimmung der Hydrolysemuster mittels HPLC18
4.2Aktivitätsbestimmung in komplexen Medien19
4.2.1Verdünnung der Enzymlösungen19
4.2.2Agardiffusionstest19
4.2.3Viskositätsmessung20
4.2.4Chromogene Substrate21
4.2.4.1Substrate mit Reaktivfarbstoffen22
4.2.4.2Substrate mit ionischen Farbstoffen23
4.2.4.3Substrat mit kationischem Farbstoff (Rutheniumrot)23
4.2.5Farbreaktionsmethode23
4.3Substratmodifikationen24
4.3.1Physikalische Substratmodifikation24
4.3.2Chemische Substratmodifikation25
4.3.2.1Löslichkeitsverbesserung25
4.3.2.2Farbstoffkopplung27
4.3.3Enzymatische Substratmodifikation31
4.3.4Substratcharakterisierung32
4.3.5Futtermittel33
4.4Enzymbestimmung durch Farbreaktion36
5.Ergebnisse37
5.1Enzymchar...