Etablierung eines veterinärmedizinischen Pharmakovigilanz-Zentrums mit pharmakogenetischer Untersuchung neurotoxischer Einzelfälle hinsichtlich einer Beteiligung des Arzneistofftransporters MDR1

Ziel dieser Dissertation war die Verknüpfung von Pharmakovigilanz und Pharmakogenetik. So wurde in Kooperation mit dem Bundesamt für Verbraucherschutz und Lebensmittelsicherheit (BVL) ein veterinärmedizinisches Pharmakovigilanz-Zentrum an der Justus-Liebig-Universität Gießen (JLU) etabliert. Dabei konnte die Zahl der Spontanmeldungen des BVL ergänzt und darüber hinaus die Mitarbeiter der Universitätskliniken sowie „externe“ praktizierende Tierärzte in allen Pharmakovigilanz-Belangen unterstützt werden. Außerdem wurde der Pharmakovigilanz-Gedanke im Rahmen der universitären Lehre weiterverbreitet. Parallel zu dieser Etablierung wurden begrenzte Populationen mehrerer im Rahmen des Pharmakovigilanz-Zentrums erfasster Fälle hinsichtlich möglicher Veränderungen im Mdr1-Gen pharmakogenetisch untersucht.
Bei Fall (1) handelte es sich dabei um einen Mdr1-defekten Australian Shepherd, der nach Gabe eines Emodepsid-haltigen Präparates für Hunde unerwünschte Arzneimittelwirkungen (UAW) in Form von neurologischen Symptomen zeigte. Die in dieser Arbeit durchgeführten Verhaltensversuche an mdr1a,b-Doppelknockout-Mäusen sollten dazu dienen, den Wirk- bzw. Toxizitätsmechanismus von Emodepsid und/oder daran beteiligter Neurotransmittersysteme im Vertebraten genauer zu charakterisieren. Die aufgetretenen Symptome nach oraler Applikation von Emodepsid deuten dabei vor allem auf eine Beteiligung serotonerger sowie dopaminerger Neurotransmitter hin. Ferner könnten jedoch auch die Neurotransmitter Acetylcholin, GABA, Glycin sowie vereinzelt auch Glutamat und Noradrenalin beteiligt sein. Für eine abschließende Beurteilung sind weiterführende neurochemische Studien notwendig. Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit bieten dabei eine gute Basis für solche Untersuchungen.
Bei Fall (2) entwickelten zwei Maine Coon Katzen neurologische Symptome nach subkutaner Applikation von Ivermectin. Bei beiden Katzen konnte in der vorliegenden Arbeit eine zuvor beschriebene 2-bp Deletion im felinen Mdr1-Gen (ABCB11930_1931del TC, syn. Mdr1 nt1930(del2)) homozygot nachgewiesen werden. Über die Hälfte der daraufhin untersuchten verwandten Katzen zeigte den Defekt in heterozygoter Ausprägung, wobei keines dieser Tiere im Falle einer früheren Behandlung mit Ivermectin UAW entwickelte. Die Ergebnisse dieser Untersuchungen unterstützen daher die Hypothese der Ivermectin-Sensitivität in Katzen mit homozygot ausgeprägtem Mdr1-Defekt. Die im Rahmen dieser Arbeit neu etablierte Genotypisierungsmethode der Allelischen Diskriminierung mittels TaqMan Assay bietet eine sehr gute Grundlage für künftige Studien zur Untersuchung der Allelhäufigkeit sowie für die routinemäßige Mdr1-Genotypisierung bei Katzen. Insgesamt können die Ergebnisse dieses Teils der Dissertation demnach dabei helfen, die Arzneimittelsicherheit von Katzen erheblich zu verbessern.
Bei Fall (3) wurde das Mdr1-Gen einer Australian Shepherd Hündin pharmakogenetisch untersucht, da das Ergebnis der zuvor im TransMIT-Zentrum für Pharmakogenetische Diagnostik (PGvet) am Institut für Pharmakologie und Toxikologie der JLU durchgeführten Mdr1-Genotypisierung eine Auffälligkeit im Vergleich zu den bislang über 30.000 dort untersuchten Hunden zeigte. Mit Hilfe der in dieser Arbeit durchgeführten Untersuchungen konnte der ermittelte heterozygote Mdr1-Status der Hündin bestätigt werden. Zusätzliche genetische Varianten des Mdr1-Gens sowie Kopienzahlvarianten (CNVs) konnten jedoch nicht identifiziert werden. Dennoch lassen die Ergebnisse vorsichtig vermuten, dass es sich um eine somatische Mutation handelt, da die Auffälligkeit bei den Untersuchungen nur gezeigt werden konnte, wenn die DNA aus Blut, nicht jedoch aus einem Backenabstrich isoliert wurde. Von einer weiteren Ursachenforschung wurde an dieser Stelle abgesehen, da das beobachtete Phänomen demzufolge wahrscheinlich nicht vererbt wird. Ob die Veränderung letztendlich einen Einfluss auf die individuelle Arzneimittelsicherheit bei der Australian Shepherd Hündin nach Applikation von MDR1-Substraten hat, bleibt unklar. Eine langfristige Beobachtung der Hündin wäre in diesem Fall wünschenswert.
Bei Fall (4) entwickelte eine Thüringer Waldziege neurologische Symptome nach der Behandlung mit Doramectin. Daraufhin wurde in der vorliegenden Arbeit das Mdr1-Transkript dieser Ziege sowie das zweier verwandter Tiere, welche ebenfalls mit Doramectin behandelt wurden, jedoch keine UAW zeigten, mittels DNA-Sequenzierung untersucht. Es zeigte sich, dass sich die Mdr1-Sequenz der betroffenen Ziege lediglich an einer Stelle im 3‘-UTR (c.3875C>A) von der Sequenz der beiden verwandten Tiere unterschied. Es kann vorsichtig vermutet werden, dass dieser heterozygot vorliegende Einzelbasenaustausch in Zusammenhang mit der vermuteten Arzneimittelsensitivität steht, bspw. durch Beeinflussung des Expressionsniveaus, der Stabilität oder der Translationseffizienz des Mdr1-mRNA-Transkripts. Zwar sind zur endgültigen Überprüfung dieser Hypothese weitere Studien notwendig, dennoch konnte mit Hilfe der durchgeführten Untersuchung erstmals eine caprine Mdr1-Sequenz aus mRNA ermittelt werden, welche die Basis für künftige und detailliertere Sequenz- und Expressionsanalysen bildet. The aim of this thesis was to combine the fields of pharmacovigilance and pharmacogenetics. For this purpose, a veterinary pharmacovigilance centre was established at the Justus Liebig University Giessen (JLU) in cooperation with the Federal Office of Consumer Protection and Food Safety (Bundesamt für Verbraucherschutz und Lebensmittelsicherheit, BVL). Within the framework of this pharmacovigilance centre, it was possible to increase the number of adverse event reports of the BVL. In addition, the employees of the Veterinary University Clinic as well as "external" veterinarians were supported in all pharmacovigilance related issues. Furthermore, the topic pharmacovigilance was expanded in the context of academic teaching. At the same time, pharmacogenetic studies on the Mdr1 gene in limited populations of cases that have been recorded as part of the pharmacovigilance centre were performed. Four of these cases are described in detail within the framework of this thesis.
In case (1), an Mdr1 deficient Australian Shepherd dog developed neurological signs following the administration of emodepside-containing tablets. Based on this case, we compiled and conducted different behavioural tests in mdr1a,b(-/-) knockout mice to characterize the mode of action or toxicity of emodepside and/or the involved neurotransmitter systems more precisely. The observed symptoms following oral application of emodepside hint primarily at a role of serotonin and dopamine. However, the neurotransmitters acetylcholine, GABA and glycine, and occasionally glutamate and noradrenaline, could also be involved. For a conclusive assessment and to investigate the exact mode of action further neurochemical studies are necessary. The results of the present study could provide a good basis for such investigations.
In case (2), two Maine Coon cats developed neurological signs following subcutaneous application of ivermectin. Both cats showed a previously described homozygous 2-bp deletion in the Mdr1 gene (ABCB11930_1931del TC, syn. Mdr1 nt1930(del2)). About half of the subsequently genotyped related cats had the heterozygous Mdr1(+/-) genotype, while none of these cats with former ivermectin treatment had a history of drug-sensitivity. These results support previous findings on ivermectin-sensitivity in cats with homozygous Mdr1 mutation. The novel TaqMan allelic discrimination assay established and validated in this work provides a useful method for future allele frequency studies as well as for routine Mdr1 genotyping in cats. Overall, the results can help to significantly improve drug safety in cats.
In case (3), the Mdr1 gene of another Australian Shepherd dog was investigated, as the result of Mdr1 genotyping carried out at the TransMIT-Zentrum für Pharmakogenetische Diagnostik (PGvet) at the Institute of Pharmacology and Toxicology of the JLU showed an abnormality that had not appeared in more than 30,000 dogs examined to date. The investigations of the present work confirmed the previously determined heterozygous Mdr1 genotype of the Australian Shepherd dog. However, genetic variants in the Mdr1 gene as well as copy number variants (CNVs) could not be verified. Nevertheless, the results hint at a somatic mutation being responsible for the abnormality detected by genotyping, as it could only be reproduced when using DNA isolated from blood, but not from buccal swabs. Therefore, no further causal research was conducted at this stage, as it was assumed that the observed phenomenon was not inherited. Whether the observed abnormality finally has an impact on individual drug safety in the Australian Shepherd in case of MDR1 substrates remains unclear. Long-term observation of the dog would be desirable in this case.
In case (4), a Thuringian goat developed neurological signs after treatment with doramectin. Sequencing of the Mdr1 transcript of this goat as well as of two related goats without drug-sensitivity was performed. Our results show that the only position where the Mdr1 sequence from the suspected drug-sensitive goat differed was in the 3′-untranslated region (c.3875C>A). It can be suspected that this heterozygous SNP could affect the expression level, stability or translation efficiency of the Mdr1 mRNA transcript and therefore might be associated with the suspected drug sensitivity. However further studies are needed to clarify this hypothesis. The results of this case provide the first Mdr1 mRNA transcript sequence of a goat and therefore represent the basis for more detailed sequence and expression analyses.