Equine chronische Sehnenläsionen: Charakterisierung mittels Magnetresonanztomographie und Matrixremodellierung durch mesenchymale Stromazellen

Die Tendinopathie der oberflächlichen Beugesehne gehört beim Pferd zu den häufigsten orthopädischen Erkrankungen, deren Heilung die Tendenz hat, in chronischen Erkrankungsprozessen zu resultieren. Für die Diagnostik und zur Überprüfung des Heilungserfolgs von Sehnenläsionen ist neben der Ultraschalluntersuchung ein Niederfeld-Magnetresonanztomographie (MRT)-System, mit dem Pferde stehend sediert untersucht werden können, etabliert. In der Humanmedizin sind dafür Hochfeld-MRT-Systeme der Goldstandard, wobei insbesondere 3-T-MRT-Systeme beim Pferd noch wenig angewendet werden. Zur Behandlung von Tendinopathien stellt die intraläsionale Injektion von mesenchymalen Stromazellen (MSCs) eine vielversprechende Therapiemethode dar. Bei akuten Läsionen haben sich positive Auswirkungen vor allem auf die Rezidivrate von Läsionen gezeigt, die wahrscheinlich in erster Linie auf den immunmodulatorischen Effekten der MSCs beruhen. Zur Wirksamkeit von MSCs bei chronischen Läsionen und den potentiellen Wirkmechanismen ist bisher jedoch wenig bekannt.
Daher war das erste Ziel der hier vorliegenden Arbeit die Charakterisierung von chronischen Sehnenläsionen in dem für Pferde etablierten Niederfeld-MRT-System und einem 3-T-Hochfeld-MRT-System. Die Untersuchungen erfolgten mit präparierten oberflächlichen Beugesehnen und wurden im Niederfeld-System in der für die beim lebenden Pferd üblichen vertikalen Ausrichtung der Sehne durchgeführt. Im Hochfeld-MRT wurden die Sehnen sowohl horizontal als auch, in Anlehnung an das Niederfeld-System, vertikal positioniert, um mögliche Auswirkungen der unterschiedlichen Lagerung auf die Darstellbarkeit der Sehnenläsionen zu erkennen. Insgesamt wurden n = 195 MRT-Bilder pro Sequenz, die dieselben anatomischen Bereiche darstellten, qualitativ mittels Score und quantitativ durch das Messen der Signalintensitäten der Sehne und gegebenenfalls auch der Läsion ausgewertet. Als Goldstandard für die Analyse der Erkennbarkeit von Läsionen diente jeweils ein histologisches Präparat pro Sehne (n = 12) als Vergleich. Zudem wurde die Übereinstimmung der qualitativen Beurteilung und der gemessenen Signalintensitäten in den unterschiedlichen Sequenzen mit der Cohens-Kappa-Statistik bzw. der Berechnung von Spearman-Rangkorrelationen und rücktransformierten logarithmierten Limits of Agreement untersucht.
Die so eindeutig als gesund oder chronisch krank identifizierten Sehnen wurden anschließend als Scaffolds in einer Zellkulturstudie verwendet, mit dem Ziel, Kenntnisse zum Einfluss von chronisch veränderter Sehnenmatrix auf die regenerationsfördernden Eigenschaften von MSCs zu gewinnen. Dafür wurde im ersten Teil der Studie zunächst das Verhalten von MSCs sechs verschiedener Spenderpferde, die auf Scaffolds einer gesunden Sehne kultiviert worden waren, im Vergleich zu MSC-Aggregat-Kulturen analysiert. MSCs des Spenderpferdes, das die Ergebnisse des ersten Versuchsteils am repräsentativsten widerspiegelte, wurden dann für die Besiedelung von Scaffolds von jeweils fünf kranken und gesunden Sehnen verwendet und bis zu 21 Tage inkubiert. Der Schwerpunkt der Untersuchungen lag in beiden Studienteilen auf der Tenogenese der MSCs, deren Expression von Matrixkomponenten und ihren matrixremodellierenden Eigenschaften. Unterschiede zwischen den Versuchsgruppen wurden mittels Mann-Whitney-U-Tests und über die Zeit mittels Wilcoxon-Vorzeichen-Rang-Tests analysiert.
Bei der Charakterisierung von chronischen Sehnenläsionen in der MRT konnten im Niederfeld-MRT mit der T1-gewichteten (w) Gradientenecho (GRE)-Sequenz alle histologisch nachgewiesenen Läsionen erkannt werden. Dies war bei den Hochfeld-Untersuchungen nur mit der T1w fast-low-angle-shot (FLASH)-Sequenz möglich, wenn die Sehne vertikal positioniert wurde. Die mit der Cohens-Kappa-Statistik analysierte Übereinstimmung der Erkennbarkeit von Läsionen in den Hochfeld-Sequenzen mit der im Niederfeld-MRT war bei Verwendung der FLASH-Sequenz oder vertikaler Orientierung der Sehne besser als bei der T1w Spinecho (SE)-Sequenz bzw. horizontaler Orientierung der Sehne. Die Übereinstimmung der Signalintensität der Sehnen im Hochfeld-MRT war zudem bei unterschiedlichen Sequenzen, aber gleicher Positionierung, höher (r = 0,964 und r = 0,957; p < 0,001) als bei der gleichen Sequenz, aber unterschiedlicher Positionierung (r = 0,833 und r = 0,802; p < 0,001).
In der Zellkulturstudie unterstützte die Kultivierung der MSCs als Aggregate die Zellfitness, was sich in einer höheren Expression der Matrixkomponenten Tenascin-C, Kollagen 1A2 und Kollagen 3A1 sowie der Wachstumsfaktoren transforming growth factor ß (TGFB)1 und -3 als bei der scaffoldbasierten Kultur zeigte (p < 0,01 für Tenascin-C an Tag 6, Kollagen 1A2 an Tag 3 und 6 und TGFB1 und -3 an Tag 3, p < 0,05 für Kollagen 3A1 an Tag 3 und TGFB1 an Tag 6). Dagegen waren die matrixremodellierenden Aktivitäten von MSCs, die auf Scaffolds kultiviert wurden, höher, was durch eine höhere Expression der Matrixmetalloproteinasen (MMPs) MMP9 und MMP13 (p < 0,01 für MMP9 an Tag 6 und MMP13 an Tag 3) bei niedrigerer Expression der tissue-inhibitors-of-metalloproteinases (TIMPs) TIMP1 und TIMP3 (p < 0,05 für TIMP1 an Tag 6 und p < 0,01 für TIMP3 an Tag 3) nachgewiesen werden konnte. Diese konnte bei der scaffoldbasierten Gruppe durch eine höhere Freisetzung von Glykosaminoglykanen in das Medium (p < 0,01 an Tag 3 und 6) und eine höhere MMP-Aktivität (p < 0,05 an Tag 6) bestätigt werden.
Die Veränderungen der extrazellulären Matrix von Sehnen mit chronischen Läsionen führten zu keinen signifikanten Unterschieden in der tenogenen Differenzierung und nur geringen Unterschieden in der Expression von Matrixkomponenten durch die MSCs. Die Matrixkomponenten Kollagen 3A1 und Decorin sowie der Wachstumsfaktor TGFB3 wurden jedoch initial (Tag 3) von MSCs auf Scaffolds von chronisch kranken Sehnen geringer exprimiert (p < 0,05 für Decorin, p < 0,01 für Kollagen 3A1 und TGFB3). Weiterhin war die Matrixremodellierung durch die MSCs innerhalb der ersten Woche der Kultur bei kranken Sehnenscaffolds reduziert, was sich in einer geringeren Expression von MMP1, MMP3, MMP13 und MMP14 sowie TIMP2 zeigte (p < 0,05 für MMP3 an Tag 6, p < 0,01 für MMP1, MMP13, MMP14 und TIMP2 an Tag 3).
In dieser Dissertation ließen sich Kenntnisse zur Diagnostik und Therapiemöglichkeiten chronischer Sehnenläsionen gewinnen. Dabei unterstützten die Ergebnisse der ersten hier eingebundenen Studie die Verwendung des für stehende Pferde konstruierten Niederfeld-MRT-Systems für die Darstellung chronischer Sehnenläsionen. Im 3-T-Hochfeld-MRT waren dafür FLASH-Sequenzen besser geeignet als SE-Sequenzen. Ausschlaggebender für die Darstellbarkeit von Sehnenläsionen war jedoch die vertikale Positionierung der Sehne im Magnetfeld, was an einzelnen zufällig ausgerichteten Sehnenfasern liegen könnte, die in dieser Position den Magic-Angle-Effekt ausgelöst haben könnten.
Hinsichtlich der Therapie von chronischen Sehnenläsionen ist eine Injektion von MSCs bisher nur bedingt zu empfehlen, da es trotz der unbeeinträchtigten tenogenen Differenzierung auf Scaffolds von chronischen Läsionsbereichen zu einer geringeren Expression verschiedener Gene kam, was als Fehlanpassung der MSCs gedeutet werden kann. Dies ist zum einen die reduzierte Expression von TGFB3, vor allem aber die verminderte Matrixremodellierung durch die MSCs, welche bei chronischen, fibrotischen Sehnenläsionen zumindest in einem gewissen Maß für den therapeutischen Erfolg erforderlich sein dürfte. Der Anpassungseffekt der MSCs könnte jedoch eventuell durch entsprechende Vorkultivierung umgangen werden, da sich das Verhalten der MSCs in beiden Gruppen über die Zeit anglich. Tendinopathies of the superficial digital flexor tendon rank among the most common orthopaedic diseases in horses and their healing often results in chronic disease processes. Besides ultrasound, a low-field magnetic resonance imaging (MRI) system which allows examinations of standing, sedated horses has been established for the diagnosis of tendon lesions and monitoring of its healing success. In human medicine, high-field MRI systems are the gold standard for this purpose, whereas 3 T MRI systems in particular are still rarely used in horses. For the treatment of tendinopathies, the intralesional injection of mesenchymal stromal cells (MSCs) is a promising therapeutic approach. In acute lesions, positive effects, especially on the recurrence rate of lesions, have been demonstrated which are probably primarily due to the immunomodulatory effects of MSCs. However, little is known about the efficiency of MSCs in chronic lesions and their potential mechanisms of action so far.
Therefore, the first aim of the present thesis was to characterise chronic tendon lesions in the low-field MRI system established for horses as well as in a 3 T high-field MRI system. For this investigation, dissected superficial digital flexor tendons were used in vertical orientation in the low-field system, as it is common for living horses. In the high-field MRI, the tendons were positioned both horizontally and, analogous to the low-field system, vertically in order to identify possible effects of the different positioning on the visualisation of tendon lesions. A total of n = 195 MRI images per sequence, representing the same anatomical areas, were evaluated qualitatively by scoring and quantitatively by measuring the signal intensities of the tendon and, where appropriate, also of the lesion. One histologic sample per tendon (n = 12) served as the gold standard for analysing the detectability of lesions. The agreement of the qualitative assessment in the different sequences was analysed based on Cohen’s kappa statistics. In addition, the agreement of the measured signal intensities was tested using the calculation of Spearman´s rank correlations and the backtransformed logarithmised limits of agreement.
The tendons unambiguously identified as either healthy or chronically diseased were subsequently used as scaffolds in a cell culture study aiming to extend the knowledge on the influence of chronically altered tendon matrix on the regeneration-promoting properties of MSCs.
For this purpose, in the first part of the study, the behaviour of MSCs from six different donor horses cultured on scaffolds from one healthy tendon was analysed in comparison to MSC aggregate cultures. Then, MSCs from the donor horse best reflecting the results of the first part of the experiment were used for seeding scaffolds of five diseased and five healthy tendons and incubated for up to 21 days. The focus in both parts of the study was on the tenogenesis of the MSCs, their expression of matrix components and their matrix remodelling properties. Differences between experimental groups were analysed using Mann-Whitney-U tests, while differences over time were analysed using Wilcoxon signed-rank tests.
Regarding the characterisation of chronic tendon lesions on MRI, all histologically proven lesions could be detected in low-field MRI using the T1-weighted (w) gradient recalled echo (GRE) sequence. In high-field examinations, this was only possible with the T1w fast-low-angle-shot (FLASH) sequence when the tendon was positioned vertically. The agreement of the detectability of lesions in the high-field sequences with the T1w GRE low-field sequence, analysed using Cohen’s kappa statistics, was better when using the FLASH sequence or vertical orientation of the tendon than when using the T1w spin-echo (SE) sequence or horizontal orientation of the tendon. Moreover, the agreement of the signal intensity of the tendons in high-field MRI was higher when using different sequences but the same positioning (r = 0.964 and r = 0.957; p < 0.001) than when using the same sequence but different positioning (r = 0.833 and r = 0.802; p < 0.001).
In the cell culture study, culturing MSCs as aggregates supported cell fitness, demonstrated by a higher expression of the matrix components tenascin-C, collagen 1A2 and collagen 3A1, and the growth factors transforming growth factor ß (TGFB)1 and -3 than in the scaffold-based culture (p < 0.01 for tenascin-C on day 6, collagen 1A2 on days 3 and 6, and TGFB1 and -3 on day 3, p < 0.05 for collagen 3A1 on day 3 and TGFB1 on day 6). In contrast, the matrix remodelling activities of MSCs cultured on scaffolds were higher, indicated by a higher expression of the matrix-metalloproteinases (MMPs) MMP9 and MMP13 (p < 0.01 for MMP9 on day 6 and MMP13 on day 3) and a lower expression of the tissue-inhibitors-of-metalloproteinases (TIMPs) TIMP1 and TIMP3 (p < 0.05 for TIMP1 on day 6 and p < 0.01 for TIMP3 on day 3). This was confirmed by a higher release of glycosaminoglycans into the medium (p < 0.01 on day 3 and 6) and a higher MMP activity (p < 0.05 on day 6) in the scaffold-based group.
The alterations in the extracellular matrix of tendons with chronic lesions did not lead to significant differences in tenogenic differentiation and only minor differences in the expression of matrix components by the MSCs. However, the matrix components collagen 3A1 and decorin as well as TGFB3 were initially (day 3) expressed less by MSCs on scaffolds of chronically diseased tendons (p < 0.05 for decorin, p < 0.01 for collagen 3A1 and TGFB3). Furthermore, matrix remodelling by MSCs was reduced within the first week of culture in diseased tendon scaffolds, demonstrated by a lower expression of MMP1, MMP3, MMP13 and MMP14, as well as TIMP2 (p < 0.05 for MMP3 at day 6, p < 0.01 for MMP1, MMP13 and MMP14, and TIMP2 at day 3).
With this doctoral thesis, the level of knowledge on diagnosis and treatment options for chronic tendon lesions could be expanded. The results of the first study included here support the use of the low-field MRI system for the visualisation of chronic tendon lesions. In 3 T high-field MRI, FLASH sequences were better suited for this than SE sequences. However, the vertical positioning of the tendon in the magnetic field was more crucial for the visualisation of tendon lesions, which might be due to randomly oriented individual tendon fibres causing the magic angle effect in that position.
With regard to the therapy of chronic tendon lesions, injection of MSCs cannot be recommended without reservation as yet. Despite the unaffected tenogenic differentiation on scaffolds of chronic lesion areas, the lowered expression level of various genes can be interpreted as a maladaptation of the MSCs. This is, on the one hand, the reduced expression of TGFB3, but more importantly, the reduced matrix remodelling by the MSCs, which is most likely required, at least to some extent, for the therapeutic success in chronic fibrotic tendon lesions. However, the adaptation effect of the MSCs could possibly be avoided by adequate pre-conditioning, as the behaviour of the MSCs in both groups converged over time.