Messung des oxidativen Schadens an caninen Erythrozyten verursacht durch die mehrtägige Gabe von verschiedenen Nichtsteroidalen Antiphlogistika (Meloxicam, Metamizol, Carprofen)

Die vorliegende Studie ist eine prospektive beobachtende Kohortenstudie, durchgeführt in der Privatklinik AniCura Kleintierspezialisten Augsburg in Deutschland im Zeitraum April 2018 bis Juli 2019, mit dem Ziel oxidativen Erythrozytenschaden durch die Gabe nichtsteroidaler Antiphlogistika bei Hunden zu untersuchen. Die Studie wurde durch die Ethikkomission in Gießen genehmigt (Vorgangsnummer: V 54 – 19 c 20 15 h 02 GI 18/17 kTV 14/2017).
Hintergrund der Studie ist, dass während der Routinebeurteilung von Blutausstrichen von Hunden im Zentrallabor der Universität Gießen vermehrt Ekzentrozyten auffielen, wenn diese mit Metamizol therapiert worden waren. Ekzentrozyten gelten als Zeichen eines oxidativen Erythrozytenschadens. Da bisher die Auswirkungen der Gabe von nichtsteroidalen Antiphlogistika auf Erythrozytenmorphologie und oxidativen Status bei Hunden nicht bekannt sind, hatte diese Studie zum Ziel dies genauer zu untersuchen.
Unsere Hypothese war, dass Metamizolgabe im Vergleich zu einer gesunden Kontrollgruppe und einer Therapie mit Meloxicam oder Carprofen zu einem Anstieg der Marker für oxidativen Erythrozytenschaden führt. Zudem sollten bisher fehlende Referenzintervalle für die Marker Superoxiddismutase und Glutathionperoxidase erstellt werden.
Material und Methoden:
Für die Ermittlung von Referenzintervallen für Superoxiddismutase und Glutathionperoxidase wurden adulte, anamnestisch sowie aufgrund einer gründlichen klinischen Untersuchung und Untersuchung eines Blutbildes und klinisch chemischer Parameter gesunde Hunde, die nicht mit nichtsteroidalen Antiphlogistika vorbehandelt wurden, eingeschlossen.
Zur Untersuchung des Einflusses der Gabe von nichtsteroidalen Antiphlogistika auf Marker des oxidativen Stresses wurden Hunde eingeschlossen, welche mindestens zehn Tage lang entweder Meloxicam, Carprofen oder Metamizol erhalten hatten. Zusätzlich wurde eine Gruppe gesunder Hunde als Vergleichsgruppe herangezogen.
Um sicherzustellen, dass sowohl die Kontrollgruppe, als auch die Gruppen von Hunden, die nichtsteroidale Antiphlogistika erhielten, ansonsten keine Erkrankungen hatten, die Erythrozyten vermehrtem oxidativem Stress aussetzen, wurde eine gründliche Anamnese durchgeführt und alle Hunde wurden klinisch untersucht und eine komplette hämatologische und blutchemische Untersuchung durchgeführt.
Ausschlußkriterien waren schwerwiegende andere als orthopädische Erkrankungen, Auffälligkeiten bei der klinischen Untersuchung (zum Beispiel Fieber oder Herzgeräusch), Verabreichung von anderen Medikamenten, die mit oxidativem Schaden in Zusammenhang gebracht werden und inflammatorische Erkrankungen (wie Polyarthritis und Diskospondylitis) oder abweichende Befunde in der klinisch-chemischen Blutuntersuchung. Um die Hunde, die nichtsteroidale Antiphlogistika erhielten hinsichtlich möglicher intraoperativer Blutungen, welche die zwischen 10 und 12 Tagen postoperativ entnommenen Proben hätten beeinflussen können, zu vergleichen, wurde zudem ein Blutungsindex erstellt.
Die Aktivität der Enzyme Superoxiddismutase und Glutathionperoxidase in bei -80°C eigefrorenem EDTA Blut wurde in einem externen veterinärmedizinischen Labor (SYNLAB.vet GmbH, Augsburg, Deutschland) gemessen.
Zudem wurden im Blutausstrich die Anzahl an Ekzentrozyten und Heinz Innenkörperchen quantifiziert indem jeweils 500 Erythrozyten zweimalig ausgezählt wurden und jeweils der Mittelwert aus den zwei Zählungen ermittelt wurde.
Statistik: Die statistische Auswertung und graphische Darstellung erfolgte mit dem Programm GraphPad Prism (Graph Pad Prism version 6.0, Graph Pad Software Inc., San Diego, USA) und dem Programm Excel (Excel 2008, Microsoft Corporation, One Mircrosoft Way, Redmond, WA98052-6399, USA).
Sechs Schlüsselparameter bestehend aus Hämoglobin, Superoxiddismutase, Glutathionperoxidase, Retikulozyten-, Ekzentrozyten- und Heinz Innenkörperchenanzahl wurden prospektiv bestimmt und mittels Shapiro-Wilk-Test und D‘Agostino-Pearson Test auf Normalverteilung untersucht und mittels Kruskal-Wallis-Test auf signifikante Unterschiede zwischen den Gruppen. Als post-hoc Analyse wurde im Falle einer Signifkanz ein Dunn’s Test durchgeführt.
Referenzintervalle für die beiden untersuchten Enzyme wurden mit dem Reference Value Advisor generiert, wie von Geffré et al. beschrieben, wobei ein robustes Verfahren nach vorheriger Box Cox Transformation Verwendung fand. Ein möglicher Alters- und Geschlechtseinfluss auf die Marker Superoxiddismutase und Glutathionperoxidase erfolge mittels Polynomialregression nach vorheriger Box Cox Transformation beziehungweise Mann-Whitney-U-Test.
Ergebnisse: Um die Referenzintervalle für Superoxiddismutase und Glutathionperoxidase zu generieren, konnten 58 Hunde in die Studie aufgenommen werden. Als Referenzbereiche mit einem 90% Konfidenzintervall wurden für Superoxiddismutase 692,0 bis 2432,9 U/g Hämoglobin mit einem medianen Wert von 1278,5 U/g Hämoglobin und für Glutathionperoxidase 186,1 bis 800,8 U/g Hämoglobin mit einem medianen Wert von 412,9 U/g Hämoglobin ermittelt.
In der Gruppe der gesunden Kontrolltiere waren 47 Hunde, während je 20 Hunde eingeschlossen wurden, welche Meloxicam oder Carprofen erhielten und 22 Hunde, welche Metamizol über 10 Tage erhalten hatten. Die Studiengruppen unterschieden sich ebenfalls nicht signifikant in Alter, im Gewicht und in der Dauer der Verabreichung sowie im Blutungsindex.
Hunde, die Metamizol erhielten, zeigten eine signifikant höhere Ekzentrozyten- (Median 14,5/500 Zellen vs 0/500 Zellen in den anderen Gruppen, p=0,0006) und Retikulozytenzahl (Median 191,4 x109/l vs 31,6 – 37,9 x109/l, p=0,0005) im Vergleich zu allen anderen Gruppen sowie eine signifikant erniedrigte Hämoglobinkonzentration (Median 13,6 g/dl vs 17,3 und 17,2 g/dl, p<0,0004) im Vergleich zur Kontrollgruppe und Hunden, die Carprofen erhielten. Es konnten keine signifikanten Unterschiede zwischen der Superoxiddismutase und Glutathionperoxidase Aktivität gefunden werden. Heinz Innenkörperchen wurden in keiner der Gruppen gefunden.
Schlussfolgerung: Es konnte ein signifikanter Zusammenhang zwischen der Gabe von Metamizol und dem Auftreten einer Retikulozytose und einer Ekzentrozytose gezeigt werden. Aufgrund der durchgeführten Untersuchungen erscheint es wahrscheinlich, dass Metamizol erhöhten oxidativen Stress bei Erythrozyten hervorruft. Mittels Messung von Glutathionperoxidase und Superoxiddismutase konnte dies nicht nachgewiesen werden.
Ein vermehrtes Auftreten von Retikulozytose ohne Anämie bei Hunden, die mit Metamizol therapiert wurden, war auffallend und sollte in zukünftigen Studien auch mittels statistischer Auswertung untersucht werden.
Im Hinblick auf die in dieser Arbeit gewonnen Erkenntnisse sollte Metamizol bei Patienten, die erhöhtem oxidativen Stress ausgesetzt oder bereits anämisch sind, nur mit Vorsicht eingesetzt werden. This study was a prospective case-controlled observational study conducted in the private referral clinic AniCura Kleintierspezialisten Augsburg in Germany between April 2018 and July 2019. The aim of the study was to investigate oxidative erythrocyte damage in dogs administered nonsteroidal anti-inflammatory drugs. Ethical approval was granted by the Ethics Committee of the Regierungspräsidium Giessen, Germany and an internal file number was recorded: V 54 – 19 c 20 15 h 02 GI 18/17 kTV 14/2017.
Background: Increased numbers of eccentrocytes have been noted during routine blood smear examination of dogs treated with metamizole at the Small Animal Clinical Pathology Laboratory, University of Giessen. Eccentrocytes are a sign of oxidative erythrocyte damage. As the effects of nonsteroidal anti-inflammatory drugs on erythrocyte morphology and oxidative status are not known, the goal of this study was to further investigate this. Our hypothesis was that treatment of dogs with metamizole would lead to an increase in markers of oxidative erythrocyte damage compared to healthy dogs or dogs treated with with meloxicam or carprofen. A secondary goal was to establish reference values for the antioxidative enzyme markers superoxide dismutase and glutathione peroxidase.
Material and methods:
To generate reference intervals for superoxide dismutase and glutathione peroxidase, healthy dogs with no abnormalities during anamnesis, a thorough clinical examination, a complete blood count, and a basic clinical biochemical profile, were included.
To evaluate for the effect of nonsteroidal anti-inflammatory drug administration on markers of oxidative erythrocyte stress, four groups of dogs were examined. These comprised a healthy control group and three groups of dogs receiving either meloxicam, carprofen or metamizole for a minimum of ten days.
To ascertain that none of the dogs included in the study had additional diseases causing increased oxidative stress of erythrocytes, a detailed history was taken, every dog was thoroughly examined and a complete blood count, as well as a basic clinical biochemical profile was performed.
Dogs were excluded from the study if they had other than orthopedic diseases for which they were treated with nonsteroidal anti-inflammatory drugs, abnormal findings during the clinical examination like heart murmurs or fever, were receiving other drugs that were associated with oxidative stress, had inflammatory disease conditions like polyarthritis or discospondylitis or showed major abnormalities in the results of the clinical biochemical profile. To further evaluate for differences between the dogs receiving one of the three nonsteroidal anti-inflammatory drugs, a bleeding score was assigned to compare groups and ascertain that the investigated parameters were not influenced by major differences in blood loss as most dogs included in the study were receiving the drugs for postoperative pain treatment.
The activity of the enzymes superoxide dismutase and glutathione peroxidase was measured in EDTA blood samples, which were frozen at -80°C and shipped on dry ice to an external laboratory (SYNLAB.vet GmbH, Augsburg, Germany).
From each dog, blood smears were evaluated for the presence of eccentrocytes and Heinz bodies and quantified by evaluating 500 erythrocytes on each blood smear twice and using the mean value for statistical analyses.
Statistics: Statistical analysis was performed with the programme GraphPad Prism (Graph Pad Prism version 6.0, Graph Pad Software Inc., San Diego, USA) and Excel (Excel 2008, Microsoft Corporation, One Mircrosoft Way, Redmond, WA98052-6399, USA). Six key parameters were prospectively determined comprising hemoglobin, superoxide dismutase and glutathione peroxidase activity and number of reticulocytes, eccentrocytes and Hein bodies. Shapiro-Wilk test and D’Agostino-Pearson test were used to investigate for normality and Kruskal-Wallis test for significance. Dunn’s test was used for post hoc analysis in the case of significance. Reference values were generated with the Reference Value Advisor as described by Geffré et al using a robust test after Box Cox transformation. To evaluate a possible influence of age and sex on the markers superoxide dismutase and glutathione peroxidase, a polynomial regression analysis after Box Cox transformation and Mann-Whitney U test, respectively, were conducted.
Results: To generate the reference intervals for superoxide dismutase and glutathione peroxidase, 58 healthy dogs were included. Reference intervals with 90% confidence interval were 692.0 to 2432.9 U/g hemoglobin for superoxide dismutase and 186.1 to 800.8 U/g hemoglobin for glutathione peroxidase with a median of 1278.5 U/g hemoglobin for superoxide dismutase and 412.9 U/g hemoglobin for glutathione peroxidase. The healthy control group comprised 47 dogs, whereas the group of dogs receiving either meloxicam or carprofen included 20 dogs and the ones receiving metamizole 22 dogs, respectively. There was no significant differences in age, body weight, duration of treatment or bleeding score between groups.
The treatment with metamizole had a significant impact on three of the six key parameters. A significant increase in eccentrocyte number (median 14.5/500 cells vs 0/500 cells in the other groups, p=0.0006) and reticulocyte concentration (median 191.4 x109/l vs 31.6 – 37.9 x109/l, p=0.0005) in dogs receiving metamizole compared to all other groups and a significant decrease in hemoglobin concentration (median 13.6 g/dl vs 17.3 and 17.2 g/dl, p=0.0004) was noted in the group of dogs receiving metamizole compared to the control group and dogs receiving carprofen.
In contrast, superoxide dismutase, glutathione peroxidase were not significantly different between groups. Heinz bodies were not seen in any of the groups.
Conclusion: In this study we could show a significant association between the treatment with metamizole and the occurrence of reticulocytosis and eccentrocytosis. Considering the findings of this study it is plausible that metamizole increases oxidative stress of erythrocytes. However, this could not be proven by measuring superoxide dismutase or glutathione peroxidase.
Additionally, an increased occurence of reticulocytosis without anemia was noted in dogs receiving metamizole and should be further investigated and statistically analysed in future studies.
The findings of this study suggest that caution might be warranted when administering metamizole to dogs with increased oxidative stress or anaemic dogs.