De Novo Referenzintervallerstellung ausgewählter Parameter der plasmatischen Gerinnung von Katzen unter besonderer Berücksichtigung der physiologischen Inhibitoren

Literaturübersicht: Referenzintervalle (RIs) schaffen die labordiagnostische Grundlage zur Erforschung hämostatischer Erkrankungen. Dabei sind insbesondere thrombotische bzw. thromboembolische Zustände sowie ihre Risikofaktoren Gegenstand veterinärmedizinischer Untersuchungen. Informationen und RIs bezüglich der physiologischen Inhibitoren der Gerinnung bei der Katze sind rar, so dass Ziel dieser prospektiven Studie eine de novo Referenzintervallermittlung unter besonderer Berücksichtigung der physiologischen Inhibitoren Antithrombin, Protein C und Protein S war. Gleichzeitig erfolgte eine Methodenvalidierung hinsichtlich der analytischen Variation (Wiederholbarkeit, Interferenzen, Stabilität) und des Einflusses des Geschlechts als Teil der biologischen Variation.
Material und Methoden: Im Februar und Juni 2014 sowie im September 2015 wurde von 62 klinisch gesunden Europäisch-Kurzhaar Katzen Bayer Animal Health GmbH (Leverkusen, Deutschland) Citratblut gewonnen, wobei die Ergebnisse von 61 dieser 62 Katzen für die Referenzintervallermittlung eingeschlossen wurden (29 kastrierte Katzen, 32 kastrierte Kater; Alter: zwischen 10 und 22 Monaten, Mittelwert: 16 Monate). Untersucht wurden die Tests Prothrombinzeit (PT), aktivierte partielle Thromboplastinzeit (aPTT), Thrombinzeit (TT), Resistenz gegen aktiviertes Protein C (APC-R), Fibrinogen, D-Dimere, anti-Faktor Xa (aFXa), Antithrombin (AT), Protein C (PC), Protein S (PS) sowie die Faktoren XII (FXII) und VIII (FVIII). Alle Analysen der untersuchten Parameter erfolgten am automatischen Gerinnungsanalysegerät STA Compact® (Stago Germany, Düsseldorf, Deutschland). Die Messungen der Parameter PC, PS, FXII und FVIII wurden für die Katze angepasst unter Erstellung einer Katzen-spezifischen Kalibrationskurve unter Verwendung von vier seriellen Verdünnungsstufen eines felinen Poolplasmas. In der Referenzintervallerstellung wurden die Ergebnisse dieser Parameter anhand dieser felinen Kalibration gemessen und mit Poolplasma von 10 klinisch gesunden Europäisch-Kurzhaar Katzen der Bayer Animal Health GmbH (5 kastrierte Kater, 5 kastrierte Katzen; Alter zwischen 18 und 50 Monaten, Mittelwert: 33,4 Monate), dem jeweils eine Aktivität von 100 % zugesprochen wurde, verglichen.
Die Methodenvalidierung beinhaltete eine Überprüfung der intra-assay und inter-assay Wiederholbarkeit sowie den Einfluss interferierender Substanzen (Lipämie, Hämolyse). Der intra-assay Variationskoeffizient (VC) wurde mittels 10-fach wiederholter Messung aus dem Poolplasma innerhalb eines Tages erhoben. Der inter-assay VC wurde berechnet anhand der Werte der Qualitätskontrollen, die an jedem Messtag (n = 6) bestimmt wurden. Als Qualitätskriterium hinsichtlich der Akzeptabilität galt der absolut zulässige Fehler (TEa), der nicht überschritten werden sollte (VCintra-assay < TEa; VCinter-assay < TEa). Mangels Informationen über einen Katzen-spezifischen TEa hämostatischer Tests wurden Daten aus der Humanmedizin verwendet.
Der Einfluss der interferierenden Größen wurde bestimmt unter Verwendung zweier Konzentrationen (Lipämie: 10 mg/ml und 2,5 mg/ml; Hämolyse: 5 mg/ml und 1,25 mg/ml) der interferierenden Substanz im Vergleich zu einer Kontrolle, der anstatt der interferierenden Substanz die gleiche Menge sterilen Natrium-Chlorids zugefügt wurde. Der Mittelwertsunterschied (Bias) zwischen den Ansätzen mit Störsubstanz und der Kontrolle wurde daraufhin berechnet und als Qualitätskriterium mit dem TEa (unter Verwendung humanmedizinischer Daten) verglichen, wobei kein Einfluss der Störsubstanz nachweisbar war, wenn Bias < TEa.
Als Teil der biologischen Variation wurde zudem ein Geschlechts-bedingter Unterschied der Ergebnisse überprüft. Hinsichtlich einer klinischen Signifikanz wurde ein Mittelwertsunterschied zwischen den Geschlechtern, der 25 % des RI übersteigen musste, festgelegt.
Statistik: Die statistische Auswertung der Daten erfolgte unter Zuhilfenahme von Microsoft Excel 2010 während die Referenzintervalle mit dem Software-Programm Reference Value Advisor 2.1 (Biostatistiques, Ecole Nationale Vétérinaire de Toulouse, Frankreich) mittels Robust-Methode (TT, PT, aPTT, APC-R Ratio und FVIII) teils mit vorheriger Box-Cox Transformation oder nicht parametrischer Methode (FXII, AT, PC, PS, D-Dimere, Fibrinogen, aFXa) erfolgte. Für den Geschlechtervergleich wurde ein ungepaarter t-Test bei normal verteilten Daten (APC-R Ratio, FVIII, FXII) oder ein Mann-Whitney Test bei nicht normal verteilten Daten (TT, PT, aPTT, AT, PC, PS, Fibrinogen, D-Dimere, aFXa) in der Software GraphPad Prism 7.02 (GraphPad Software, Inc.; La Jolla, CA 92037 USA) genutzt.
Ergebnisse: Es konnten folgende RIs ermittelt werden:
PT: 10,1- 12,5 Sek, aPTT: 10,8 – 14,1 Sek; TT: 14,1 – 19,6 Sek; APC-R Ratio: 2,0 – 3,7; PC = 103 – 385 %; PS: 88 – 388 %; AT: 112 – 162 %; FVIII: 56 – 124 %; FXII: 62 -131 %; aFXa: 0,0-0,1 UI/ml; D-Dimere: 0,0 – 0,4 µg/ml; Fibrinogen: 1,0 – 2,6 g/l.
Die Parameter PC und PS zeigten dabei eine zweigeteilte Datenverteilung, wobei die Werte jeweils einer tiefen (PC: Werte bis 153 %; PS: Werte bis 148 %) und einer hohen Population (PC: Werte ab 306 %; PS: Werte ab 209 %) zugeordnet werden konnten. Alle Katzen mit hoher Protein C-Aktivität wiesen dabei ebenfalls eine hohe Protein S-Aktivität auf.
In der Methodenvalidierung erfüllten alle Parameter das Akzeptabilitätskriterium hinsichtlich der intra-assay Wiederholbarkeit. Dabei lagen die Variationskoeffizienten von PC, PS, FVIII, APC-R Ratio, TT, PT, aPTT, AT und FXII: ≤ 3 % während die intra-assay Variationskoeffizienten von Fibrinogen bei 5 % und der D-Dimere bei 18 % lagen.
Bei der Untersuchung der inter-assay Wiederholbarkeit lagen die Variationskoeffizienten der aPTT, PT und von PS geringgradig über den jeweiligen Wertes des humanmedizinischen TEa (aPTT: 6 %; PT: 5 %; PS: 21 %). Auch der inter-assay VC von FVIII überstieg den humanmedizinischen TEa (FVIII: 13 %). Die Parameter PC, AT, D-Dimere und Fibrinogen erfüllten das Akzeptabilitätskriterium (PC: 8 %; AT: 6 %; D-Dimere: 8 %; Fibrinogen: 7%).
Die Untersuchungen zum Einfluss von Interferenzen zeigte, dass eine Lipämie (bei 10 mg/ml sowie bei 2,5 mg/ml) sowie eine Hämolyse (bei 5 mg/ml sowie bei 1,25 mg/ml) einen Einfluss auf die Messung der D-Dimere und von aFXa haben, die in der hohen Konzentration lipämischen Plasmas nicht mehr messbar waren. Weiterhin konnte gezeigt werden, dass eine starke Hämolyse (5 mg/ml) einen Einfluss auf die Messung von Antithrombin hat, die zur Überschreitung des Akzeptabilitätskriteriums führte.
Hinsichtlich des Einflusses des Geschlechts waren bei der Messung von AT, PT und TT signifikante Unterschiede nachweisbar, wobei Katzen eine kürzere Thrombinzeit (p = 0,0016), eine längere Prothrombinzeit (p = 0,024) und eine höhere Antithrombin-Aktivität (p = 0,0071) aufwiesen als Kater. Da diese Unterschiede nicht zu einem Mittelwertsunterschied führten, der 25 % des RI überschritt, waren sie als klinisch nicht relevant einzustufen.
Schlussfolgerung: Die hier ermittelten RIs können abgesehen von Protein C und Protein S zukünftig als populationsbasierte RIs zur Unterscheidung zwischen Gesundheit und Krankheit herangezogen werden. Aufgrund der breiten Spanne der Ergebnisse von PC und PS sind diese anhand einer gesunden Population von Katzen erhobenen RIs für den klinischen Alltag nicht nutzbar. Hier ist die Verwendung intraindividueller RIs bzw. die Betrachtung der Änderung von Ergebnissen im Verlauf anzuraten. Ungewöhnlich war weiterhin die zweigeteilte Population in der Datenverteilung von Protein C und Protein S, aufgrund derer die Theorie aufgestellt werden konnte, dass Katzen in zwei verschiedene Gruppen der Inhibitoren (PC und PS) eingeteilt werden können: solche mit hoher und solche mit normaler Aktivität. Dies sollte in weiteren Studien überprüft werden.
In der Methodenvalidierung wurden hinsichtlich der Wiederholbarkeit über einen kurzen sowie einen langen Zeitraum zufriedenstellende Ergebnisse erzielt, die zwar teils geringfügig oberhalb des TEa lagen (als Grenzwert für die Akzeptabilität), der hier verwendete TEa jedoch mangels veterinärmedizinischer Daten aus der Humanmedizin entnommen wurde und somit nicht als absoluter Grenzwert sondern eher als Richtwert zu sehen ist. Hinsichtlich des Einflusses interferierenden Substanzen wurde ein Einfluss einer Lipämie auf die Messung der D-Dimere und aFXa sowie ein Einfluss einer Hämolyse auf die Messung der D-Dimere, aFXa und bei Verwendung hoher Konzentrationen ebenfalls auf AT nachgewiesen.
Ein Einfluss des Geschlechts konnte für die TT, PT und AT nachgewiesen werden, erwies sich jedoch als klinisch nicht relevant.