Nephroprotektive Effekte des Angiotensin II Rezeptor Agonisten Compound 21 im Modell der Anti-Thy1-induzierten chronisch-progressiven Glomerulosklerose der Ratte

Chronic-progressive glomerular disease represents one of the most common causes of endstage renal failure worldwide. The disease course is generally characterized by a progressive loss of renal function up to terminal organ failure and often of nephrotic proteinuria. In affected kidneys, histology is characterised typically by fibrosis, inflammation and proliferation.
This study was designed to explore the preventive potential of selective AT2-receptor stimulation by Compound 21 on the progressive loss of function in the animal model of the anti-thy1-induced, chronic-progressive glomerulosclerosis of the rat. Furthermore it was analyzed, whether benefical actions of AT2-receptor stimulation is associated with the antifibrotic, anti-inflammatory and antiproliferative effects, all of which are under controversial discussion. The animal model of the anti-thy1-induced, chronic-progressive glomerulosclerosis is based on male Wistar-rats, which undergo uninephrectomy and subsequent intravenous injection of mAb 1-22-3 antibody. This antibody is specifically directed against thy1-like epitopes of mesangial cells and leads to a complement-dependent cell lysis. In the course of the disease, this initial iatrogenic insult develops into an autoprogressive process of renal damage that ends in terminal uremia. This animal model is independent from extrarenal injurious stimuli and so it is especially suitable for investigations of chronic–progressive kidney diseases, which course is primarily controlled by intrarenal processes. Thirty male Wistar-rats were arranged in three experimental groups: con = normal control animals (n=6); cGS = animals with uninephrectomy and injection of mAb 1-22-3 antibody, but without Compound 21 treatment (n=12); cGS+C21 = animals with uninephrectomy, antibody injection and Compound 21 treatment (n=12).
Twenty weeks after the induction of the cGS, blood, urine and the remaining kidney were collected from the rats in order to measure representative parameters of renal function, fibrosis, inflammation and proliferation. The representative parameters of renal function were proteinuria, systolic blood pressure, plasma concentration of urea and creatinine and glomerular filtration rate. Furthermore, analysis involved histological matrix score, deposition of collagen I, renal infiltration by macrophages and lymphocytes and number of proliferative and apoptotic renal cells. In addition to these parameters, renal expression of TGF-ß1, fibronectin, col I and α-SMA were measured on level of mRNA and proteins. Expression of PAI-1, TIMP-1, MCP-1, IL6, TNF-α and the AT2-receptor was determined at the level of mRNA-expression.
In summary, the results of this investigation show that treatment with Compound 21 as a selective agonist of the AT2-receptor leads to an effective slow down of progression in rats with cGS. Thereby, protective actions of Compound 21 involved antifibrotic, antiinflammatory and antiproliferative effects.
In particular, treatment of cGS with Compound 21 led to a significant decrease of fibrotic parameters. At histological level: glomerular (-27% (p < 0.01)), tubulointerstitial (-61% (p < 0.001)) matrix score; glomerular (-39% (p < 0.005)), tubulointerstitial (-40% (p < 0.005)) col I deposition. At the level of mRNA-expression: TGF-ß1 -39%, fibronectin -42% (p < 0.005), col I -37% (p < 0.005), PAI-1 -49% (p < 0.01) and TIMP-1 -58%. And at the level of protein-expression: TGF-ß1 -77%, fibronectin -21% and col I -36%. Selective stimulation of the AT2-receptor led to a decreases of the inflammatory parameters at the different investigation levels, too: histology: glomerular (-55% (p < 0.05)), tubulointerstitial (-77% (p < 0.001)) number of CD3-positive cells and glomerular (-58% (p < 0.01)), tubulointerstitial (-50% (p < 0.01)) number of ED1-positive cells; mRNA-Expression: IL6 - 48% (p < 0.05), TNF-α -35% (p < 0.05) and MCP-1 -59% (p < 0.05). Furthermore the proliferative and apoptotic activity of renal cells was significantly reduced by Compound 21 treatment at the different levels: histology: glomerular (-61% (p < 0.01)), tubulointerstitial (-69% (p < 0i001) number of PCNA- positive cells and glomerular (-55% (p < 0.01)), tubulointerstitial (-39% (p < 0.05)) number of TUNEL-positive cells. mRNA-expression: α-SMA -45% (p < 0.05). Protein-expression: α-SMA -30%. Via these pathways, AT2-receptor stimulation led to a substantial decrease of diseases progression and accordingly the animals showed improved renal function: plasma concentration of creatinine -39% (p < 0.05) and urea -34% and glomerular filtration rate -42% (p < 0.05). Systolic blood pressure was decreased by -8% (p <0.05) and proteinuria by -21%, respectively.
The results of this work provide an important contribution in the understanding in the progression of glomerular renal disease in veterinary medicine. Furthermore, they establish AT2 receptor stimulation as novel and effective treatment opportunity. These findings suggest that that AT2-receptor stimulation may be beneficial in human chronic-progressive glomerular disease as well. In future investigations the combination of Compound 21 with the established agents and therapy concepts of the chronic-progressive kidney diseases should be examined in order to optimize those and potentially even to develop new ones. Häufigste Ursache des terminalen Nierenversagens stellen chronisch-progressive Glomerulonephritiden dar, die durch einen progressiven Funktionsverlust bis hin zum totalen Versagen des Organs mit Ausprägung eines nephrotischen Syndroms gekennzeichnet sind. Histologisch lassen sich in derart betroffenen Nieren zur gleichen Zeit Merkmale der Fibrose, der Inflammation, und der Proliferation vorfinden.
Ziel dieser Arbeit war es, erstmals durch die selektive Stimulation des AT2-Rezeptors mittels Compound 21 den progressiven Funktionsverlust im Tiermodell der Anti-Thy1-induzierten, chronisch-progressiven Glomerulosklerose der Ratte zu verhindern. Des Weiteren sollte überprüft werden, ob die AT2-Rezeptor Stimulation in vivo tatsächlich mit aktuell intensiv und kontrovers diskutierten antifibrotischen, antiinflammatorischen und antiproliferativen Effekten einhergeht. Im Tiermodell der Anti-Thy1-induzierten, chronisch-progressiven Glomerulosklerose wurde männliche Wistar-Ratten nach einer Uninephrektomie der monoklonale Antikörper mAb 1-22-3 intravenös appliziert. Dieser Antikörper ist spezifisch gegen Thy1-ähnliche Epitope der Mesangialzellen gerichtet und führt zu dessen Komplementvermittelter Lyse. Dieser initiale Insult geht in einen auto-progressiven, renalen Schädigungsprozess über, die schließlich im totalen Versagen des Organs mündet. Da dieses Modell unabhängig von extrarenalen Reizen ist, eignet es sich besonders zur Untersuchung chronisch-progressiver Nierenerkrankungen, deren Krankheitsverlauf durch rein intrarenale Prozesse gesteuert wird. Es wurden 30 männliche Wistar-Ratten in folgender Gruppeneinteilung verwendet: Kon = gesunde zweinierige Tiere (n=6); cGS = cGS, Uni nx, keine Therapie (n=12); cGS+C21 = cGS, Uni nx, Compound 21 Behandlung (n=12).
Zwanzig Wochen nach Induktion der cGS wurde den Tieren Blut, Urin und die verbliebene Niere nach Perfusion entnommen, um darin repräsentative Parameter der Nierenfunktion, Fibrose, Inflammation und Proliferation zu bestimmen. Dazu gehört die Proteinurie, der syst. Blutdruck, die Plasma- und Urinkreatinin- und –harnstoffwerte und die glomeruläre Filtrationsrate. Des Weiteren wurde histologisch der Matrixscore, die Kol I-Expression, die Infiltration durch Makrophagen und Lymphozyten, der Anteil proliferierender Zellen und apoptotischer Zellen jeweils im glomerulären und tubulointerstitiellen Kompartment bestimmt. Zusätzlich wurde die renale Expression von TGF-ß1, Fibronektin, Kol I und α-SMA auf mRNS- und Proteinebene und die renale Expression von PAI-1, TIMP-1, MCP-1, IL 6, TNF-α und des AT2-Rezeptors auf mRNS-Ebene untersucht.
Die Resultate der aufgeführten Untersuchungen zeigen zusammenfassend, dass Compound 21 als Agonist des AT2-Rezeptors in einer Langzeittherapie effektiv die Progression der cGS verlangsamt und dabei sowohl antifibrotische und antiinflammatorische, als auch antiproliferative Effekte vermittelt. Im Einzelnen führte die Behandlung der chronischen Glomerulosklerose mit Compound 21 zu einer erheblichen Verminderung der Fibroseparameter, sowohl auf histologischer Ebene: glomerulärer (-27% (p < 0,01)), tubulointerstitieller (-61% (p < 0,01)) Matrixscore, glomeruläre (-39% (p < 0,05)) und tubulointerstitielle (-40% (p < 0,05)) Kol I Deposition; auf Ebene der mRNS-Expression: TGF-ß -39%, Fibronektin -42% (p < 0,05), Kol I -37% (p < 0,05), PAI-1 -49% (p < 0,01) und TIMP-1 -58%; als auch auf Ebene der Protein-Expression: TGF-ß -77%, Fibronektin -21% und Kol I -36%. Zudem kommt es durch die selektive Stimulation des AT2-Rezeptors zu einer deutlichen Reduktion der inflammatorischen Parameter auf den unterschiedlichen Untersuchungsebenen: Histologie: Anteil CD3-positiver Zellen glomerulär -55% (p < 0,05), tubulointerstitiell -77% (p < 0,001) und Anteil ED1-positiver Zellen glomerulär - 58%(p < 0,01) und tubulointerstitiell -50% (p < 0,01); mRNS-Expression: IL6 -48% (p < 0,05), TNF-α -35% (p < 0,05) und MCP-1 -59% (p < 0,05). Zudem wird die proliferative und apoptotische Aktivität der renalen Zellen durch die Compound 21 Behandlungen der Versuchstiere stark vermindert (Anteil PCNA-positiver Zellen glomerulär -61% (p < 0,01), tubulointerstitielle -69% (p < 0,001), Anteil TUNEL-positiver Zellen glomerulär -55% (p < 0,01) und tubulointerstitielle -39% (p < 0,05), α-SMA mRNS-Expression -45% (p < 0,05) und α-SMA Protein-Expression -30%). Die Gesamtheit dieser Ergebnisse führen zu einer verzögerten Progression der Erkrankung und dementsprechend weisen die Tiere eine verbesserte renale Funktion auf: Blutdruck -8% (p < 0,05), Proteinurie -21%, Kreatininkonzentration im Serum -39% (p < 0,05), Harnstoffkonzentration im Serum -34% und GFR +42% (p < 0,05).
Nebenwirkungen des Compound 21 konnten an den behandelten Tieren der cGS+C21 Gruppe über den gesamten Verlauf des Versuches nicht nachgewiesen werden, trotz der täglichen Kontrollen des Allgemeinbefindens der Tiere und den regelmäßigen Messungen des Körpergewichtes, des Blutdruckes und der Urinanalyse. Durch die orale Applikation konnten keine Affektionen des Gastrointestinaltraktes in Form von Inappetenz, Erbrechen oder veränderter Kotkonsistenz beobachtet werden.
In der Zusammenschau aller Ergebnisse liefert diese Arbeit einen Beitrag zum Verständnis und der pharmakologischen Interventionsmöglichkeiten bei chronisch-progressiven Nierenerkrankungen in der Veterinärmedizin und eventuell in der Humanmedizin durch ihren Modellcharackter. Die tierexperimentell ermittelten Ergebnisse lassen zudem vermuten, dass eine Therapie chronisch-progressiver Nierenerkrankungen mit Compound 21, als einem Agonisten des AT2-Rezeptors, auch im humanmedizinischen Bereich zu vergleichbaren positiven Effekten führt und so die Progression der Erkrankung verlangsamt wird. Zukünftige Arbeiten sollten sich mit der Kombination dieses Wirkstoffes mit den heute etablierten Wirkstoffen und Therapiekonzepten der chronisch-progressiven Nierenerkrankungen auseinandersetzten, um diese weiter zu optimieren und um gegebenen Falls neue Therapiekonzepte zu entwickeln.