Analyse des Substratspektrums der ClpCP-Protease aus Corynebacterium glutamicum

Der konditionale Abbau von Proteinen durch ATP-abhängige Proteasen ist ein wichtiges
regulatorisches Prinzip. Mit ClgR, dem Transkriptionsregulator von Genen, die an der
Proteolyse und der DNA-Reparatur beteiligt sind, und GlnK, dem PII-Typ-Regulator der
Stickstoffmangel-Antwort, sind bereits zwei Substrate der ClpCP-Protease aus
Corynebacterium glutamicum bekannt. Ziel dieser Arbeit war die Aufklärung weiterer
Substrate von ClpCP und die Bestimmung von Sequenzmotiven innerhalb dieser
Substrate, die für eine Erkennung durch ClpC wichtig sind. Folgende Ergebnisse wurden
dabei erzielt:
1. Zur Co-Reinigung von Substraten mit inaktiven ClpP-Derivaten, bei denen der
katalytisch aktive Serin-Rest durch einen Glycin-Rest ersetzt worden war und die
einen C-terminalen StrepTag-II trugen, wurden die beiden so genannten
Substratfallenstämme ClpCP1TRAP und ClpCP2TRAP konstruiert. StrepTactin-
Affinitätschromatographie von Extrakten dieser Stämme führte zur Co-Reinigung von
61 Proteinen mit ClpP1*-ST bzw. ClpP2*-ST, von denen 14 in mindestens fünf der
zehn Reinigungen mit inaktivem ClpP1 und ClpP2 auftraten. Die Proteine konnten in
unterschiedliche Funktionsklassen wie Translation, Chaperone,
Aminosäuremetabolismus und Energiemetabolismus eingruppiert werden. Eine Co-
Reinigung war auch mit ClpP-Derivaten möglich, die den Serin-Glycin-Austausch
nicht besaßen, was auf eine Inaktivierung dieser Derivate bereits durch den Cterminalen
StrepTag-II hindeutet.
2. Kontrollexperimente unterstützten eine Spezifität der Co-Reinigung dieser Proteine
für ClpP1 und ClpP2. Die plasmid-kodierte E1-Untereinheit des α-Ketoglutarat-
Dehydrogenase-Komplexes (OdhA) mit C-terminalem StrepTag-II wurde ohne Co-
Reinigung weiterer Proteine aus demselben Stammhintergrund isoliert wie ClpP1*-
ST oder ClpP2*-ST. Eine Co-Reinigung von Proteinen mit prozessiertem ClpP1, das
ein N-terminales StrepTag-II trägt, war ebenfalls nicht möglich.
3. Aus den mit ClpP co-gereinigten Proteinen wurden 10 N-terminale und 10 Cterminale
putative ClpC-Erkennungssequenzen abgeleitet. Durch Bestimmung der
Halbwertszeit von Fusionsproteinen mit den 10 N-terminalen Sequenzmotiven
konnten acht Motive bestimmt werden, die in Anwesenheit von ClpC einen negativen
Einfluss auf die Stabilität der Fusionsproteine hatten. Diese Motive könnten also
Erkennungssequenzen von ClpC darstellen.