Molekulare Technologien zur funktionellen Analyse der Bakterien und Archaeen

Projektarbeit aus dem Jahr 2013 im Fachbereich Biologie - Mikrobiologie, Molekularbiologie, Note: 1,7, Universität Bayreuth, Sprache: Deutsch, Abstract: Die mikrobielle Ökologie beschäftigt sich mit der Wechselwirkung von Mikroorganismen mit anderen Mikroben und mit ihrer Umwelt. Im Vordergrund stehen die Identifizierung und Charakterisierung der Biodiversität von Mikroorganismen und die damit verbundenen mikrobiellen Aktivitäten. Die Untersuchung der Populationen erfolgt mit molekularbiologischer Methode basierend auf der Analyse des Gens für die 16SrRNA. Die 16SrRNA ist als Untereinheit Bestandteil des Ribosomen. Diese ist besonders gut geeignet auf Grund ihrer universellen Verbreitung, der gut handhabbaren Größe, der hochkonservierten und hochvariablen Sequenzbereiche. Durch die 16SrRNA sind die Identifizierung und die phylogenetische Anordnung der Lebewesen durch Erstellung eines Stammbaumes möglich.Zu Beginn der Analyse mikrobieller Eigenschaften wird die DNA aus der Umweltprobe wie z.B. die des Faulschlammes extrahiert. Mit den nun enthaltenen DNA Extrakten werden die Konzentration und die Reinheit mittels photometrischer Messung (NanoDrop) ermittelt. Danach kann durch die PCR (Polymerase-Kettenreaktion) die gezielte Amplifizierung der 16SrRNA-Gene erfolgen. Bei der PCR werden sequenzspezifische Primer für Bakterien und Archaeen verwendet, die an die spezifischen, konservierten Regionen der 16SrRNA hybridisieren. Als quantitative Kontrolle kann das Auftragen der PCR-Produkte auf das Agarose-Gel dienen. Die sogenannten Inserts können mit Hilfe der T4-DNA-Ligase in einen Vektor ligiert werden (Klonierung) und dann anschließend in kompetente Zellen transformiert, vervielfältigt und isoliert werden. Beim anschließenden Klon-Screening kommt das Blau-Weiß-Screening zur Verwendung, in dem durch eine Blau-Färbung der Kolonien gezeigt werden kann, dass transformierte, kompetente Zellen identifiziert werden können. Weitere Methoden wie die RFLP-Analyse, die DGGE können eine genauere Auswahl geeigneter Klone differenzieren. Durch eine quantitative PCR (qPCR) mit spezifischen Plasmid- und Insert gerichteten Primern können die Produkte nach dem Auftragen auf ein Agarose-Gel überprüft und sequenziert werden. Außerdem kann somit die relative Abundanz der Zielgruppen bestimmt werden. Durch die Sequenzierung ist es mittels BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) möglich die nächst kultivierbaren und unkultivierbaren Verwandten als Referenzen zu ermitteln und ein Alignement zu erstellen, welches dann unter Berücksichtigung der Ähnlichkeiten der homologen Regionen zur Erstellung eines Stammbaumes dient.